Пятница , 24 сентября 2021
Главная / Разное / Ветрянка переносчики: Вопрос-ответ

Ветрянка переносчики: Вопрос-ответ

Содержание

Ветряная оспа (ветрянка) — симптомы, лечение

Общие сведения

Ветряная оспа (ветрянка) является острым, высококонтагиозным вирусным заболеванием, распространенным во всем мире. Как только среди восприимчивых лиц возникает один случай, предотвратить вспышку заболевания очень сложно. В то время, как в детстве ветряная оспа является относительно легким заболеванием, у взрослых она принимает более серьезные формы. Она может быть смертельной, особенно у новорожденных и у лиц с ослабленным иммунитетом.

Возбудитель, вирус ветряной оспы — зостер (VZV), передается воздушно-капельным путем или при прямом контакте, а больные обычно контагиозны за несколько дней до начала сыпи и до момента, когда сыпь покрывается корочкой. Передача инфекции через третьих лиц и предметы обихода невозможна.

VZV является двунитевым ДНК вирусом, принадлежащим к семейству герпес-вирусов. Известен только один серотип, и человек является единственным его резервуаром.

Вирус ветряной оспы VZV попадает в организм человека через слизистую оболочку носоглотки и почти без исключения вызывает клинические проявления болезни у восприимчивых лиц. После инфицирования вирус остается в латентной форме в нервных узлах и в результате активизации VZV может вызвать опоясывающий лишай (или опоясывающий герпес –

Herpeszoster) – заболевание, в основном поражающее пожилых людей и лиц с ослабленным иммунитетом.

Вероятность заболеть

Контагиозность вируса ветряной оспы поистине уникальна – она составляет 100%. Заболеванию ветряной оспой подвержены все возрастные группы. Однако эта инфекция чаще всего поражает детей. Около половины заболеваний в детском возрасте приходится на возраст от 5 до 9 лет, реже болеют дети 1–4 и 10–14 лет. Около 10% среди заболевших составляют лица 14 лет и старше. Среди этой возрастной группы за последние 5 лет заболеваемость ветрянкой возросла с 28 до 58 на 100 тыс. населения. Дети первых месяцев жизни чаще всего резистентны к этой инфекции. Однако недоношенные и ослабленные другими заболеваниями дети могут тяжело болеть ветряной оспой.

Максимальная заболеваемость ветряной оспой наблюдается в осенне-зимние месяцы. Эпидемические вспышки отмечаются, главным образом, в организованных коллективах среди детей дошкольного возраста. Дети, посещающие детские сады и ясли, болеют ветрянкой в 7 раз чаще, чем неорганизованные дети.

В группу риска также входят больные с иммунодефицитами, включая ВИЧ-инфекцию. Описаны тяжелые случаи ветряной оспы у детей, получавших гормональную терапию стероидными препаратами. Описаны также случаи врожденной ветряной оспы у детей, чьи матери переболели ветрянкой в первой половине беременности; перинатальная инфекция имеет место у детей, матери которых заболели за 5 дней до и 48 часов после рождения ребенка.

У лиц с тяжелым иммунодефицитом различной этиологии (в редком случае при ВИЧ-инфекции и у пациентов после пересадки органов; часто при акклиматизации, снижении иммунитета, вызванном сильным стрессом) возможно повторное заболевание.

Симптомы

Инкубационный период обычно составляет 14-16 (10-21) дней. После ветряной оспы вирус остается в сенсорных нервных узлах, где он может позднее активизироваться и вызвать опоясывающий герпес. Симптомы ветряной оспы появляются в виде зудящей везикулярной сыпи, обычно начинающейся на лице и верхней части туловища и первоначально сопровождающейся температурой и общим недомоганием. Наличие везикулезной сыпи на коже волосистой части головы является характерным симптомом ветрянки. Элементы сыпи выглядят как мелкие (несколько миллиметров в диаметре) пузырьки, возвышающиеся над покрасневшей поверхностью кожи, заполненные прозрачной жидкостью (в которой содержится вирус ветряной оспы). По мере постепенного распространения сыпи на тело и конечности первые пузырьки (везикулы) подсыхают. Обычно все корочки исчезают через 7-10 дней.

Осложнения после перенесенного заболевания

Хотя ветряная оспа (ветрянка) является относительно доброкачественно протекающим детским заболеванием и редко рассматривается в качестве значительной проблемы общественного здравоохранения, течение заболевания может иногда осложняться пневмонией или энцефалитом, вызванными вирусом VZV, что может привести к стойким последствиям или смертельному исходу. Наиболее опасны буллезная, геморрагическая или гангренозные формы ветряной оспы. Обезображивающие рубцы могут образоваться в результате вторичного инфицирования везикул; кроме того, в результате такого инфицирования может возникнуть некротический фасцит или сепсис.

Осложнения ветряной оспы регистрируются с частотой 5-6%, они служат поводом для госпитализации в 0,3-0,5% пациентов. От общего числа случаев – это несколько тысяч в год. 30% осложнений – неврологические, 20% – пневмонии и бронхиты, 45% – местные осложнения (например, стрептадермия), сопровождающиеся образованием рубцов на коже.

Среди других серьезных проявлений встречается пневмония (чаще у взрослых), редко – синдром врожденной ветряной оспы (вызванный ветрянкой, перенесенной в течение первых 20 недель беременности) и перинатальная ветряная оспа новорожденных, матери которых заболевают ветрянкой в период за 5 дней до и 48 часов после родов. У больных с иммунодефицитами, включая ВИЧ-инфекцию, ветряная оспа протекает в тяжелой форме. Ветряная оспа в тяжелой форме и смертные случаи также могут иметь место у детей, принимающих стероидные гормоны для лечения астмы. В целом, осложнения и смертельные исходы при ветряной оспе чаще наблюдаются среди взрослых, чем у детей.

У 10-20% переболевших вирус ветряной оспы пожизненно остается в нервных ганглиях и в дальнейшем вызывает другое заболевание, которое может проявиться в более старшем возрасте – опоясывающий лишай или герпес (Herpes zoster). Опоясывающий герпес характеризуется затяжными и мучительными невралгическими болями, а также имеет ряд осложнений в виде поражений нервной системы и внутренних органов – параличей, нарушения зрения. Люди с опоясывающим герпесом могут быть источником заражения ветряной оспой.

Смертность

Показатель летальности (число смертей на 100 000 случаев) среди здоровых взрослых в 30-40 раз выше, чем среди детей в возрасте 5-9 лет. Смертность – 1 на 60 000 случаев.

Лечение

Лечение ветряной оспы, в основном, сводится к предотвращению бактериальных осложнений. Во избежание распространения вируса необходимо тщательно соблюдать правила гигиены, включающие ежедневный душ и подстригание ногтей у маленьких детей (для предотвращения расчесывания и разрушения пузырьков сыпи).

Применение антивирусных средств во время лечения, таких как ацикловир, является оправданным только для недоношенных детей, пациентов с нарушениями иммунной системы и взрослых (в связи с большей тяжестью течения инфекции). Традиционное средство «лечения» ветряной оспы – «зеленка» – не является сколь-либо эффективным средством, гораздо эффективнее ванны и ванночки с небольшим добавлением соды, антигистаминные средства и обезболивающие мази для снятия зуда.

Эффективность вакцинации

Помимо вакцинации, нет никаких контрмер по борьбе с распространением ветряной оспы или частотой опоясывающего лишая в восприимчивой к инфекции популяции. Иммуноглобулин ветряной оспы – зостера и лекарства против герпеса стоят очень дорого и, в основном, применяются для профилактики уже после контакта с инфекцией или для лечения ветряной оспы у людей с высоким риском развития тяжелой формы заболевания. По причине крайней контагиозности ветрянки в мире заболевают почти все дети или молодые взрослые. Каждый год с 1990 по 1994 г., до того, как появилась вакцина против ветряной оспы, в США регистрировалось около 4 миллионов случаев заболевания. Из этого числа приблизительно 10,000 заболевших нуждались в госпитализации и 100 больных умирали.

Вакцины против ветряной оспы, полученные с использованием штамма Ока вируса VZV, имеются на рынке с 1994 года. Положительные результаты относительно безопасности, эффективности и анализа эффективности затрат подтвердили обоснованность их внедрения в программы детской иммунизации ряда индустриально развитых стран. После наблюдения за исследуемыми группами населения в течение 20 лет в Японии и 10 лет в США более 90% иммунокомпетентных лиц, вакцинированных в детстве, все еще имели защиту от ветряной оспы.

В ответ на вакцинацию около 95% детей вырабатывают антитела, и 70-90% будут защищены от инфекции, по меньшей мере, на 7-10 лет после вакцинации. Согласно данным японских исследователей (Япония – первая страна, в которой была зарегистрирована вакцина), иммунитет против ветрянки длится 10-20 лет. Можно с уверенностью говорить о том, что циркулирующий вирус способствует «ревакцинации» привитых, увеличивая длительность иммунитета.

Исследования показывают, что может быть эффективна и экстренная вакцинация – когда вакцина вводится в течение 96 часов (предпочтительно 72 часов) с момента контакта с VZV, можно ожидать, по крайней мере, 90%-ную защитную эффективность. Лечение от ветряной оспы лицам, получивших вакцину, протекает значительно легче, чем у не привитых.

Вакцины

Имеющиеся на данный момент на рынке вакцины против ветряной оспы получены с использованием так называемого штамма VZV Ока, который был модифицирован посредством последовательного воспроизводства в различных клеточных культурах. Разные составы таких живых, аттенуированных вакцин прошли тщательные испытания и были одобрены для применения в Японии, Республике Корея, США, а также ряде стран Европы. Некоторые вакцины одобрены для применения в возрасте от 9 месяцев и старше.

С точки зрения логистики и эпидемиологической ситуации, оптимальным возрастом для вакцинации против ветряной оспы является 12-24 месяца. В Японии и нескольких других странах одна доза вакцины считается достаточной, вне зависимости от возраста. В США 2 дозы вакцины, вводимые с 4-8-недельным интервалом, рекомендованы для подростков и взрослых, среди которых у 78% сероконверсия наблюдалась после первой дозы и у 99% после второй дозы вакцины.

Согласно современному календарю прививок США дети получают 2 дозы вакцины (1-ю дозу – в 12 месяцев, 2-ю — в 6 лет).

Подробнее о вакцинах

Последние эпидемии

Заболеваемость ветряной оспой распространена повсеместно во всех странах мира. В России отмечается ежегодный рост числа заболеваний этой инфекции. С 1998 по 2007 г. заболеваемость ветрянкой увеличивалась в 1,8 раза ежегодно, каждый год регистрируется 500–700 тыс. случаев ветряной оспы.

Интересен такой факт: вакцина против ветряной оспы стала доступна в Российской Федерации в 2009 году. С конца 2013 по 2015 год был перерыв в поставках вакцины в нашу страну. По данным Роспотребнадзора, в 2015 году был отмечен рост заболеваемости ветрянкой по сравнению с 2014 годом на 16%.

Исторические сведения и интересные факты

Впервые ветряная оспа была описана в середине XVI века в Италии врачами Vidus-Vidius и Ingranus. Длительное время ветряная оспа не признавалась самостоятельным заболеванием и считалась разновидностью натуральной оспы. После того как в 1911 г. в содержимом ветряночных пузырьков был обнаружен возбудитель ветряной оспы, заболевание стали считать отдельной нозологической формой. Сам вирус был выделен лишь в 1958 г. Вирус ветряной оспы поражает только человека, единственным резервуаром инфекции является также человек.

инфекции животных и следующая человеческая пандемия» — главные идеи книги Дэвида Кваммена

Обзор книги подготовлен командой сервиса ключевых идей литературы по бизнесу и саморазвитию MakeRight.Ru.

6812 просмотров

Книга была издана еще в 2013 году, но в 2020 году она приобрела особое значение в связи с пандемией коронавируса. Ее автор, научный журналист Дэвид Кваммен, прогнозировал, что новая эпидемия возникнет либо в лесах Африки, либо на рынке в Азии.

Зоонозы, то есть инфекции, которые передаются от животных к людям, ежегодно уносят жизни миллионов человек. Они влияли на ход истории, ставили человечество под угрозу вымирания и напоминали человеку, что он не царь природы.

Чума, «испанка», Эбола, желтая лихорадка, ВИЧ, малярия, свиной грипп, птичий грипп, разного рода паразитические инфекции — это лишь часть зоонозов, которых насчитывается великое множество. Мы подвержены им лишь в чуть меньшей степени, чем животные. Ведь мы животные по своему происхождению и здоровью, а потому служим благодатной почвой для инфекций и вирусов, свойственных животному миру.

Опасность зоонозов в том, что каждое новое заражение представляет собой загадку. Чаще всего болеют дикие животные, и чтобы выяснить, кто именно является разносчиком инфекции, приходится прикладывать титанические усилия: снаряжать экспедиции, брать на анализ мазки и кровь диких животных, а для этого их еще нужно найти и поймать.

Новый зооноз сложно обнаружить, особенно если симптомы схожи с другими заболеваниями, а прежде не было зарегистрировано похожих случаев. Для его выявления требуется массовая заболеваемость, когда у заболевших явно совпадают симптомы, не описанные ранее.

Наука знает примеры заражения в лабораторных условиях, в момент изучения больных животных, поиска вакцины от вируса или экспериментов с бактериологическими культурами. Иногда зараженному лаборанту или ученому удается помочь, иногда — нет. Некоторые инфекции настолько опасны, что для заражения достаточно крошечного прокола кожи или легкой царапины иголкой шприца.

Дэвид Кваммен сравнивает патогены с хищниками. Настоящие хищники нападают и убивают извне, патогены пожирают добычу изнутри, разрушая органы и вызывая болезни. Зоонозные патогены сложно обнаружить, их поиск часто превращается в настоящий детектив, где к верному выводу приходят после множества исключений, методом дедукции. И поиски могут длиться не один год.

Мало обнаружить носителя вируса или инфекции — нужно еще понять, как человек заразился, какие условия для этого необходимы, насколько широко распространилась зараза и как от нее защититься. Всем этим вопросам автор посвятил свою книгу.

Важные идеи книги.

Идея № 1. Чтобы выявить новую вирусную инфекцию, требуется время и тщательный анализ данных

Так в свое время случилось с таинственным вирусом Хендра (Хендра — городок в Австралии, где в 1994 году произошла первая вспышка заболевания). Все началось с одной заболевшей скаковой лошади в конюшне конезаводчика Вика Рейла. Лошадь тяжело дышала, отказывалась от еды и с трудом передвигалась. Ее морда и конечности припухли.

Рейл вызвал ветеринара Питера Рида, который не мог сказать ничего определенного. Температура была высокой, но лошадь как будто не страдала от боли, хотя выглядела очень больной. Он сделал ей инъекцию антибиотика и анальгетика и ушел с намерением с утра навестить пациентку. Однако утром лошадь уже умерла. Рид отметил пену, выступившую у нее на губах.

Это было только начало несчастий. Через две недели заболели еще семь лошадей. Некоторые умерли сами, другие так бились и мучились от судорог и конвульсий, что их пришлось усыпить. Вскрытие показало кровоизлияние во все внутренние органы.

Но причина одновременной смерти сразу семи лошадей оставалась неясной. Возможно, это неизвестный токсин, африканская болезнь лошадей (которая, правда, не появлялась в Австралии) или намеренное отравление — но чем? Все, что Рид мог противопоставить неизвестной хвори, — антибиотики и анальгетики, но они не помогали.

Животными дело не кончилось. Вскоре заболел Вик Рейл, за ним его конюх Рэй Анвин. Сначала их болезнь приняли за грипп. Анвин отлежался дома и выжил, Рейл умер в больнице. В его легких была кровь и скопление жидкости, в которой обнаружился вирус. С ветеринаром Ридом ничего не случилось.

Ветеринары отправили образцы тканей и мазков, взятых у павших лошадей, в Лабораторию здоровья животных. С образцами работали микробиологи, чтобы выявить вирус и удостовериться, что именно он вызывает смертельную болезнь лошадей.

Им удалось обнаружить ранее не известный вирус. Он частично был похож на парамиксовирусы, особенно на их подгруппу — морбилливирусы, к которым относятся собачья чумка, вирус риндерпеста и человеческая корь. Сначала его классифицировали как лошадиную корь или лошадиный морбилливирус. Но когда выяснилось, что Рейл умер от того же вируса, его переименовали в вирус Хендра, по названию городка.

Это был лишь первый этап исследования вируса. Предстояло выяснить, откуда и почему он появился и что спровоцировало это появление.

Некоторые опасные вирусы прячутся внутри «резервуара», то есть естественного хозяина. Это могут быть мыши, крысы, комары, белки, кролики и другие мелкие животные. Сами они лишь переносят вирус, не страдая от него. Если хозяин находится в благоприятной естественной, биологически разнообразной среде, патоген, живущий в нем, может никак себя не проявлять. Но если экосистема разрушается, вирус рвется наружу.

Из всех зоонозов вирусы — самые коварные из-за своей неуловимости, абсолютной устойчивости к антибиотикам, высокой смертности, которую они вызывают. Поэтому очень важно понять, откуда пришло заражение, кто хозяин нового вируса и почему он распространился на другие виды.

До 1995 года ученые строили разные предположения, пока не случилось очередное несчастье, которое помогло прояснить картину.

На другом конце Австралии заболел фермер Марк Престон. Это был второй приступ болезни, первый случился год назад, в 1994-м. Тогда у Престона начались головные боли, рвота, немели конечности. Был поставлен предварительный диагноз — менингит неясной этиологии.

Вскоре симптомы исчезли, и он вернулся к работе на ферме, где разводил сахарный тростник и лошадей. Через год все повторилось. С симптомами тяжелого энцефалита он снова попал в больницу, где, несмотря на интенсивное лечение, умер через месяц в бессознательном состоянии.

Вскрытие выявило вирус Хендры. Выяснилось, что год назад на ферме заболели и умерли две лошади, диагноз так и не был поставлен. Образцы их тканей сохранились, в них тоже обнаружился вирус Хендры. Жена Престона, однако, осталась здоровой.

После долгих поисков обнаружилось, что вирус Хендры разносили летучие лисицы, самая крупная разновидность рода рукокрылых, к которому относятся и летучие мыши. Многочисленные пробы, взятые у этих животных за несколько лет, показали, что почти половина популяции летучих лисиц Восточной Австралии либо бывшие носители Хендры, либо переносят его до сих пор.

Это вызвало панику и призывы к радикальным мерам, вроде полного истребления летучих лисиц. Однако оказалось, что они не могут сразу заразить человека. Для переноса нужен промежуточный хозяин, и в его роли выступает лошадь.

На каждое животное патогены действуют по-разному. Естественные хозяева приспосабливаются к ним, союз с патогеном для них безвреден. Они могут лишь выделять вирус или другой патоген, заражая им других.

Вирус не может как следует размножиться в естественном хозяине, для этого ему нужен усилитель — существо, в котором он бурно размножается и разносится.

Усилитель может заболеть или не заболеть, но он производит столько вирусов, что неизбежно заражает других животных. В Австралии немало людей изучают летучих лисиц, выхаживают их, держат дома, получают царапины и укусы от своих питомцев. Но ни один из них не заболел. Лишь когда лошадь выступила усилителем, произошло заражение человека.

С 1994 года вспышек Хендры больше не зафиксировано, никто не может сказать, когда она появится снова и появится ли вообще. Но другие зоонозы не дремлют.

Идея № 2. Вспышка зоонозов связана с экологическим кризисом и нарушением человеком природного равновесия

Примерно с середины прошлого века и до нынешнего времени один зооноз вспыхивает за другим. Вирусы Мачупо, Марбург, Ласса, Эбола, ВИЧ, птичий грипп, Нипах, лихорадка Западного Нила, свиной грипп, коронавирусы и многие другие то и дело вспыхивают в разных частях света.

И все это — не случайность, а результат человеческой деятельности, результат воздействия двух кризисов, экологического и медицинского. Из-за их пересечения человечество столкнулось с неизвестными заболеваниями, переходящими от животных к людям.

В последние годы это происходит все чаще. Антропогенный фактор, разрушающий экологию, приводит к тому, что животные патогены избирают для размножения человеческую популяцию, а люди распространяют эти патогены все шире и со все большей скоростью.

Человек своей деятельностью разрушает природные экосистемы все быстрее. Расширяются лесозаготовки, все больше строится дорог, истребляются и употребляются в пищу дикие животные. Леса расчищают под пастбища для скота. Растут города и пригороды, воздух и вода загрязняется, сточные воды сливаются в океаны, климат меняется под воздействием антропогенного фактора.

Природное равновесие сохранялось в течение очень долгого времени, пока население Земли не было таким многочисленным и использовало простые инструменты. Сегодня в связи с ростом и населения и высоких технологий это воздействие становится критическим.

Тропические леса — самые биологически разнообразные и сложные экосистемы. Они служат домом для множества видов микроорганизмов, часто едва изученных. Огромное количество этих микроорганизмов — вирусы, бактерии, грибы, протисты, многие из них — паразиты. Вирусы представляют собой огромную семью — виросферу.

Многие из них обитают в тропических лесах, внедряясь в животное, бактерию, грибок или растение. Все это находится в биологическом равновесии, их численность и ореал обитания ограничены. Пока нам известны немногие вроде Эболы или Марбурга, остальные до поры до времени спят внутри своих хозяев, многие из которых тоже не известны науке.

Иногда эти вирусы поражают обезьян или других лесных животных, но трупы в тропических лесах быстро разлагаются, и люди не могут знать, отчего эти животные погибли.

Когда природные экосистемы разрушаются, это дает возможность паразитам и их хозяевам выйти за пределы своих лесов.

Во время лесоповала или истребления лесных животных паразиты теряют прежних хозяев, перед ними стоит задача — как можно быстрее найти новых. Человек для вирусов — желанная добыча, к тому же многочисленная и легкая, так что голод им точно не грозит.

Это означает не только небольшие вспышки новых инфекций, но и настоящие эпидемии, подобные СПИД. СПИД убивает миллионы человек, десятки миллионов им инфицированы. А началось все с инфекции, которая распространилась среди шимпанзе на юго-востоке Камеруна.

Одного из этих шимпанзе убил охотник в 1908 году и заразился одним из вирусов, вызывающих иммунодефицит, во время разделки туши. Тогда никто не обратил на это внимания. В 1959 году подобным вирусом заразился житель Киншасы, которого укусила обезьяна. Его анализы сохранились, и по ним намного позднее установили, что это первый зарегистрированный случай ВИЧ.

СПИД — лишь одна из эпидемий, вызванная вирусом, перенесенным с другого вида. Будущая пандемия может быть вызвана вирусом животного из тропического леса или с китайского рынка (что, вероятно, мы и наблюдаем на примере коронавируса). СПИД и ВИЧ подтачивают здоровье медленно, следующая инфекция может действовать куда быстрее.

Инфекции могут затухать и снова просыпаться. Так, в Африке снова распространяется туберкулез, особенно среди страдающих СПИДом, у которых повреждена работа иммунитета. Также известны повторные вспышки желтой лихорадки, которую переносят комары от инфицированных животных к здоровым людям.

Разносят комары и лихорадку денге, впервые описанную еще в конце 18 века. К началу 20 века заболевало относительно мало людей, но после Второй мировой войны она активно распространилась в Юго-Восточной Азии. Автор связывает это с ростом городов, частыми перемещениями людей, плохой системой сточных вод, обилием комаров и другими факторами.

Вирусы, заражающие один вид животных, при определенных условиях вполне могут поражать и другой вид. Большинство новых патогенов, вызывающих заболевания, относятся к зоонозным.

Идея № 3. Часто главным распространителем зоонозного вируса является сам человек

Так случилось с вирусом Эбола, точнее с целой группой эболавирусов. Впервые проявление такого вируса зарегистрировано в 1976 году на африканском континенте. С тех пор Эбола время от времени вспыхивала в Судане, Уганде, Габоне, Кот-д’Ивуаре и других местах.

В 1994 году в Габоне заболело 32 человека из лагеря старателей на реке Ивиндо. У них начались головная боль, лихорадка, рвота, у некоторых наблюдались кровотечения. Откуда пришла зараза, было непонятно, однако один из заболевших вспомнил, что в их лагерь забрел больной шимпанзе, который вел себя странно. Работник убил обезьяну и съел ее.

В другом лагере один из старателей просто наткнулся на мертвую гориллу, отрезал от трупа куски мяса и принес в лагерь, где их съели. Все, кто ел это мясо, умерли. В это время в лесу замечали много мертвых горилл.

Людей из лагеря перевезли в общую больницу. Вскоре похожие симптомы начались в ближайших к больнице деревнях и внутри самой больницы. Выяснилось, что в одной из деревень жила целительница и колдунья — нганга, которую посещало много больных, не доверявших традиционной медицине.

Из посетителей этой колдуньи вирусом Эбола заболело 49 человек, 29 из них умерли. Возможно, именно целительница, через руки которой прошло множество больных, способствовала распространению вируса.

Через год, в июле 1996-го, в лесном охотничьем лагере недалеко от селения Буэ, была зарегистрирована новая вспышка. Несколько охотников заболели, трое умерли в лесу, остальных госпитализировали. Один из них сбежал из больницы, пожелав лечиться у местного нганги. Колдун оказался бессилен, охотник умер. Следом за ним умерли колдун и его родственники.

Охотники употребляли в пищу местную дичь, возможно, они заразились от нее. Они упоминали и о том, что видели много трупов обезьян вблизи лагеря. Но дальше переносчиками болезни стали они сами, распространяя вирус от человека к человеку.

Часть пациентов из больницы Буэ перевели в Либревиль, столицу Габона, где они и умерли. Заболел один из их лечащих врачей. Он решил, что будет лечиться в Йоханнесбурге, где условия лучше. Сам он выжил, но медсестра в больнице Йоханнесбурга, которая с ним контактировала, заразилась и умерла. Вирус распространился по всему континенту.

У болезни, вспыхнувшей сначала в разных частях Африки, были общие черты. В месте заражения вырубались леса и велась охота. Поблизости были мертвые обезьяны. Вторичные случаи болезни были связаны с помещением в больницу или обращением к целителям. Смертность от Эболы превышает 60 процентов.

Известно, что вирус Эболы убил огромное количество горных горилл, от которых, как предполагают, он передался человеку. Но и человек передает гориллам свои болезни, такие как ветрянка, корь, пневмония, полиомиелит и другие. Этот перенос происходит везде в лесу, где больные люди оставляют свою слюну, мокроту или экскременты. Такой перенос от человека к животному называется антропоноз.

В 1996 году в Заире, в городе Киквит с населением около 200 тысяч человек заболел мужчина, который жил неподалеку от леса и часто рубил там деревья для своих нужд. Через неделю он умер, заразив свою семью и десять своих знакомых.

Некоторые из этих знакомых попали в больницы, где в свою очередь заразили врачей, медсестер и монахинь, которые помогали выхаживать больных.

Местные медицинские чиновники решили, что это просто вспышка дизентерии, и не обратили на нее особого внимания, что позволило болезни распространяться дальше, среди пациентов и персонала других больниц Киквита.

Прежде чем было установлено, что на самом деле это вирус Эбола, умерло 245 человек, среди которых было 60 человек из больничного персонала.

Эболавирусы распространяются быстро, от человека к человеку, но вспышки болезней, вызываемых ими, долго не длятся.

У них есть свой хозяин, к которому они приспособились. В организме человека они сталкиваются с чужеродной средой, в которой не приживаются. Только поэтому они не вызывают огромных эпидемий, а ограничиваются кратковременными вспышками. Та или иная форма эболавируса, поразив людей, постепенно заходит в тупик и обрывается.

Но нет гарантии, что так будет всегда. Если что-то нарушает равновесие среды обитания вирусов, происходят экстраординарные события, катаклизмы, изменение климата, зоонозы могут вести себя совсем по-другому, и тогда последствия могут быть ужасными.

Но в любом случае человеку всегда следует помнить о простых гигиенических мерах. Если он живет поблизости от леса или часто посещает его, ни в коем случае нельзя приближаться к трупам диких животных, тем более трогать их.

Идея № 4. Зоонозы доказывают природную связь между людьми и другими видами

Человек — тоже примат, инфекционные болезни перешли к нему, слегка в другой форме, от других животных-хозяев. И хотя по строгой классификации только 60% инфекционных заболеваний считаются зоонозами, Кваммен считает, что на самом деле их больше.

Хорошее доказательство связи между человеком и другими животными — малярия.

Далеко не все ученые относят ее к зоонозам, но у автора другая точка зрения. Комары переносят малярию от одного хозяина к другому. Но сами они лишь переносчики, не хозяева. Комары не ставят себе задачу заразить как можно больше людей, они как кровососущие просто используют кровь человека для размножения. У обезьян и у птиц есть свои виды малярии, отличные от человеческой. Это считалось доказательством того, что малярия — не зооноз.

Малярию человека вызывают одноклеточные организмы — протисты видов Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale и Plasmodium malariae. Всего к роду Plasmodium относится больше 200 видов, большинство из которых заражает птиц, рептилий и других животных. И только эти четыре вида передаются человеку комарами.

Самый опасный вид — Plasmodium falciparum, вызывающий злокачественную малярию, тяжелую болезнь с частым летальным исходом, распространенную в некоторых странах Африки. Особенно уязвимы дети.

Откуда и когда злокачественная малярия Falciparum и другие виды протиста перешли к человеку?

Исследования показали, что вид P. Falciparum имеет общего предка с двумя разными видами птичьих плазмодий. Ученые сделали вывод, что он перешел к человеку от птиц, что такой перенос случился около 6000 лет назад и связан с развитием сельского хозяйства, когда вокруг обрабатываемых полей начали расти многочисленные поселения.

Для поддержания каждой инфекции необходимо достаточно большое скопление людей. Малярия, как и корь, имеет особенность замирать, если хозяев слишком мало.

При обработке земли и строительстве поселений нужно было рыть канавы и делать насыпи, что создавало благоприятную среду для комаров Anopheles, разносящих малярию. Одомашнивание курицы около 8000 лет назад в Юго-Восточной Азии, возможно, было еще одним фактором, способствующим этому, так как одной из двух рассматриваемых форм птичьей плазмодии является Plasmodium gallinaceum, известный как заражающий птицу.

Эта точка зрения на птичье происхождение малярии falciparum была выдвинута в 1991 году, но в последнее время она выглядит не выглядит столь убедительной.

Более поздние исследования показали, что ближайшим известным родственником P. falciparum является P. reichenowi, малярийный паразит, который заражает шимпанзе в Центральной и Западной Африке. Он старше, чем P. falciparum, и обладает большей генетической изменчивостью. Существует теория, что именно от него произошел P. falciparum, когда перешел от шимпанзе к людям.

Комары кусали и шимпанзе, и человека, пересаживая штаммы обезьяньей плазмодии в человека. А уже в человеческом организме P. reichenowi сумел выжить, размножиться и постепенно мутировать до P. falciparum, который комары могли переносить уже от человека к человеку.

Более поздние исследования, проведенные недавно, доказали, что обезьяны бонобо, наиболее близкие к человеку, могут быть носителями человеческого P. falciparum. Он переходит от бонобо к человеку при помощи тех же комаров. И мутация паразита в данном случае не нужна. Точно так же и бонобо может заразиться малярией от человека. Та же картина наблюдается и с гориллами, а значит, малярия — это все же зооноз в чистом виде, и искоренить ее намного сложнее, чем кажется.

Идея № 5. Мясо дикого животного может быть заражено коронавирусами, переходящими к человеку

Так в свое время произошло с атипичной пневмонией (тяжелый острый респираторный синдром — ТОРС, вызванный коронавирусом SARS, предшественником COVID-19). Установлено, что источником SARS стала цивета, хищное млекопитающее из семейства виверровых. Но прежде чем это было доказано, произошло немало трагических событий.

В ноябре 2002 года заболел 46-летний мужчина из Фошаня в китайской провинции Гуандун. Его лихорадило, дыхание было затруднено. Ухаживавшая за ним жена, тетя, ее муж и дочь, навещавшие его в больнице, тоже заболели.

Больной не мог сказать, где он заразился, но история болезни зафиксировала, что он участвовал в приготовлении экзотических блюд, в которые входило мясо змей, куриц, кошек. Такой набор вполне типичен для Гуандуна, где на рынке можно приобрести самых экзотических животных для употребления в пищу.

Через несколько недель в Шеньжене заболел шеф-повар ресторана, который готовил мясо диких животных. Работал он в Шеньжене, жил в городе Хэйюань, куда и вернулся, почувствовав себя плохо, и обратился к врачам. Его поместили в больницу, где он заразил шесть человек персонала, а затем перевезли в больницу в другом городе, на машине скорой помощи, в которой заразился транспортировавший его врач.

Вскоре после этого в окрестностях Гуанчжоу было зафиксировано еще 27 случаев непонятной болезни — с головной болью, ознобом, температурой, кашлем с кровавой мокротой и разрушением легких. Часть заболевших были медработниками, один — поваром, в чьи блюда входили змеи, циветы, лисицы и крысы.

Тогда уже власти обратили внимание на странную болезнь, которую назвали атипичной пневмонией. Но пневмония — симптом, нужно было искать возбудителя болезни. Любое воспаление легких, не связанное с известной инфекцией, можно считать атипичной пневмонией. Власти разослали по больницам памятку, где описывались характерные симптомы болезни и меры по изоляции таких больных. Этим дело и ограничилось, но ненадолго.

Появился больной, которого эпидемиологи называют «суперазносчиком», — это человек, заражающий максимально большое количество человек, значительно превышающее средний показатель. В данном случае это был торговец морепродуктами и рыбой. Некоторые ученые подчеркивают, что во время вспышки болезни именно таких людей следует изолировать в первую очередь, однако это не всегда возможно.

Он попал в больницу Гуанчжоу в 2003 году, за два дня заразил как минимум 30 медработников, а после ухудшения состояния его перевели в другую больницу, где специализировались на лечении атипичной пневмонии. Там он заразил еще двух врачей, двух медсестер и водителя скорой помощи — во время транспортировки он кашлял, отплевывался, его рвало.

Во время интубации уже в больнице ему в горло вставили трубку, по которой откачивали слизь и мокроту из легких, и все это разбрызгивалось по полу и халатам медперсонала.

В этой больнице он заразил 23 врача, 18 пациентов и их родственников, а также 19 членов собственной семьи. Самому ему удалось выжить, но большинство зараженных умерли. В той же больнице от него заразился пациент, врач по профессии, который привез болезнь в Гонконг. От него заразилась пожилая женщина из Канады, которая вернулась домой и вызвала вспышку SARS в Торонто.

Американский бизнесмен заразился SARS во время визита в Китай, попал в госпиталь во вьетнамском Ханое, куда прибыл знаменитый инфекционист Карло Урбани. Ему удалось определить, что новая болезнь — не птичий грипп, тоже вызывающий атипичную пневмонию, а что-то более серьезное. К сожалению, он заразился и умер сам. Однако он успел убедить правительство Вьетнама объявить карантин.

С ноября 2002 года по июль 2003-го заразились 8096 человек в 29 странах, 774 из них умерли.

Никакого эффективного препарата против коронавируса SARS не существует. Однако его носитель обнаружился на рынках Китая и Гонконга — это была цивета.

В Китае и Гонконге существует множество любителей «дикой кухни». Употребление в пищу диких животных, согласно традиции, способствовало обретению удачи и процветания. Животные продавались прямо на рынках. Многие были специально выращены на фермах, но были и непосредственно пойманные в дикой природе. После вспышки атипичной пневмонии все они были обследованы, и коронавирус был выявлен только у циветы.

Коронавирус, подобный SARS, был обнаружен у летучих мышей рода Rhinolophus, которых часто подают к столу в китайских и гонконгских ресторанах «дикой кухни». Кваммен советует: если в китайском ресторане вам предложат тушеную летучую мышь, лучше выберите лапшу, но его совет уже запоздал.

Идея № 6. Зоонозы кажутся редкими экзотическими болезнями, но это не так

Изучение зоонозов имеет огромное значение. Многим это утверждение может показаться странным: ведь в мире и без зоонозов немало хворей, которые уносят множество жизней — диабет, сердечно-сосудистые заболевания, астма, рак и другие? Ну заболеют несколько десятков или сотен человек в далеких странах какими-то странными болезнями, заразившись от обезьян или летучих мышей. Разве это касается цивилизованного мира?

Автор считает, что зоонозы представляют собой опасность для всего человечества, как это уже было с чумой в Средние века, источниками и резервуарами которой стали суслики, крысы, сурки, кошки и другие животные.

Чем быстрее паразит может перейти и восстановиться в новом хозяине, для которого инфекция несмертельна, тем выше его вирулентность. Если новый хозяин существо социальное и обитает в большой популяции себе подобных, эпидемия неизбежна.

Примером может служить пандемия СПИДа. Об этой болезни уже давно никто не думает как о зоонозе, а между тем это именно так.

В конце 1980 года в Медицинский центр Калифорнийского университета обратились пятеро мужчин-гомосексуалов с непонятной легочной инфекцией. Она была вызвана грибком, с которым обычно иммунная система легко справляется. Но по какой-то причине этого не происходило.

Кроме того, у всех была грибковая инфекция — кандидоз полости рта. Она часто встречается у новорожденных, диабетиков и людей с пониженным иммунитетом, для взрослых здоровых людей она редкое явление.

Как показали анализы, Т-клеток, которые должны были бороться с инфекциями, было очень мало, недостаточно для того, чтобы справиться с инфекцией. Лечивший больных доктор, иммунолог Майкл Готтлиб, описал необычный случай в научной статье как странный вид пневмонии, вызванный грибком-пневмоцистой. Названия она не получила.

Чуть позже в Нью-Йорке дерматолог Эдвин Фридман-Кин внес в свой регулярный отчет о заболеваемости и смертности пациентов сообщение о 26 случаях саркомы Капоши, неагрессивной и редкой формы рака, которая у некоторых заболевших сочеталась с пневмоцистной пневмонией. Все больные были молодыми гомосексуалами. Восемь пациентов скоропостижно скончались.

С 1980 по 1982 год саркома Капоши вдруг вспыхнула у группы молодых иммигрантов с Гаити, все они были гомосексуалами. Саркома тоже сочеталась с пневмоцистной пневмонией, кандидозом рта и горла и пониженным количеством лимфоцитов. 10 из 20 человек быстро умерли. Врачи, которые их лечили, знали о похожих случаях в Нью-Йорке и Лос-Анжелесе и обратили внимание на схожие симптомы, а главное — иммунодефицит.

Нулевым пациентом со СПИДом считается Гаэтан Дюга, молодой канадец, красавец-бортпроводник. Писали, что он заразился вирусом в Африке и распространил его среди геев Европы и Америки. Сейчас эта точка зрения уже не подтверждается, но, несомненно, что он был активным передатчиком инфекции в городах США, где он бывал благодаря своей профессии.

Он утверждал, что за всю жизнь у него было около 2500 партнеров. За свои аппетиты Дюга поплатился: у него тоже развились саркома Капоши, пневмония и другие инфекции, и в возрасте 31 года он умер от почечной недостаточности.

Однако Дюга сам заразился вирусом СПИДа и, скорее всего, не в Африке или на Гаити, а в Канаде или США, поскольку вирус уже был и там, и в Европе, где похожие симптомы описывались и у женщин.

Сначала болезнь назвали синдромом гей-связанного иммунодефицита, поскольку решили, что она свойственна только активным геям. Впоследствии, когда ее стали часто регистрировать у гаитян, героиновых наркоманов и людей, страдающих гемофилией, ее условно стали называть болезнью 4 «г» (4-H disease): Haiti, homosexual, heroine, hemophilia.

Название СПИД (AIDS) она получила только тогда, когда обнаружилось, что болеют и гетеросексуалы, и не имеющие зависимостей люди, и те, кто не страдает гемофилией. Просто эти категории входили в группу риска, как и те, кто предпочитал незащищенный секс, поскольку чаще всего СПИД передавался половым путем.

В 1983 году из тканей больных удалось выделить ретровирус, получивший название ВИЧ (вирус иммунодефицита человека). Дальнейшие исследования вируса показали, что родственным ретровирусом болеют макаки-резусы в неволе, но на человека этот вирус не переходит.

Но однажды, когда исследовали обезьяну-мангабея, болеющую проказой, ее кровь ввели макакам, чтобы проверить, передается ли зараза от обезьяны одной породы к другой. Вместе с проказой макаки получили еще и ВИЧ, причем того штамма, которым болеют люди.

Изначально, видимо, этот вирус был свойствен только обезьянам-мангабеям, а, эволюционировав, заразил человека. Впоследствии тот же вирус обнаружился и у шимпанзе в Юго-Восточном Камеруне. А поскольку люди в Камеруне часто употребляют в пищу сырое обезьянье мясо, соприкасаются с кровью больного животного во время разделки или охоты, таким образом вирус перекочевал в человека и разлетелся по миру.

Кто-то из новых хозяев приспособился к вирусу и стал его носителем, передавая в основном половым путем или другим способом попадания в кровь, других он быстро убивал. Сами шимпанзе заболевали СПИДом, убивая своих сородичей, кусая их и получая раны от клыков.

На Гаити был собственный подтип вируса. Оттуда или из Африки, где-то в конце 1960-х годов, вирус попал в США и долгое время находился в спящем состоянии, приспосабливаясь к новым хозяевам.

К гемофиликам он попадал через слабые капилляры и систему кровообращения, к наркоманам — через грязный шприц, к геям — путем незащищенных половых контактов. Симптомы нарастали медленно, вирус мутировал и наконец пришел к своей нынешней смертоносной форме.

Таким образом, было доказано, что ВИЧ относится к зоонозам и может вызвать настоящую пандемию во всех частях света.

Идея № 7. Бурный рост популяции можно сравнить со вспышкой болезни

Так называют этот рост экологи. Вспышка — это внезапное огромное увеличение популяции одного вида. Она свойственна кузнечикам, мышам, морским звездам какого-то одного вида, тогда как другие виды сохраняют прежнюю численность.

В течение двух столетий человеческая популяция демонстрирует взрывное увеличение численности. Со времени изобретения сельского хозяйства население увеличилось в 333 раза. В 14 раз оно выросло после морового поветрия, Черной Смерти. В 2011 году наша численность составляла 7 миллиардов и около 70 млн человек прибавляется ежегодно. Ни один вид крупнотелых животных не демонстрировал такую динамику роста.

Сегодня нас обслуживает 1,3 млрд домашних коров, которым требуются пастбища. Они пасутся там, где раньше паслись дикие животные, сокращая и истощая их среду обитания. И это тоже антропогенный фактор.

Наши города переполнены, и легко добраться из одного города в другой, даже на разных концах света. И при этом нас поджидают все новые вирусы, пришедшие из той самой природы, с которой мы так варварски обращаемся.

Так что следующая пандемия неизбежна, и она, судя по всему, будет одним из видов гриппа.

Испанский грипп 1918–1919 годов унес жизни около 50 млн человек, и до сих пор так и не создана вакцина, которая гарантирует, что подобное не повторится. Вирус «испанки» оказался одним из видов современного свиного гриппа h2N1, но это выяснилось только в 2005 году. От обычного сезонного гриппа в год умирает 250 тыс. человек, а больных в среднем 3 млн. Птичий и свиной грипп (и нынешний COVID-19) — зоонозы.

Зоонозы опасны и могут вспыхнуть в любой момент, но это не означает, что они непременно уничтожат человечество, хотя исключать такую возможность нельзя. Наиболее угрожающие из всех вирусов — коронавирусы. У них высокая эволюционная способность, вызывающая эпидемии в животных, а теперь и человеческих популяциях.

Эпидемиологи во всем мире пытаются контролировать ситуацию. Они следят, когда появится новый вирус, ищут животное, которое его вызывает, бьют тревогу, чтобы объявить карантин. Остальное зависит от политиков, ученых, общественного мнения.

А главное — мы должны понимать, что вспышки зоонозов происходят не сами по себе, что человечество несет за них ответственность. И если мы не остановимся в своем истреблении природы, может случиться настоящая пандемия. Сегодняшняя экологическая обстановка такова, что создает все новые и новые возможности для распространения все новых вирусов от диких животных к человеку. А поскольку людей много, для вирусов это может оказаться прекрасной средой обитания, как только они приспособятся к нашим телам.

Ну и не стоит забывать, что каждый в отдельности должен соблюдать гигиену — мыть руки, избегать незащищенного секса, не употреблять мясо диких животных и не соприкасаться с ними. Все это снижает возможность заражения.

Несмотря на то что стиль изложения Дэвида Кваммена довольно бесстрастный, описываемые истории вряд ли смогут оставить читателя равнодушным.

Книга оказалась пророческой — в 2020 году ВОЗ объявила пандемию коронавируса Covid-19, распространившегося на рынке Южного Китая, где в антисанитарных условиях продавали и убивали диких животных. Нарушая равновесие в природе, человек увеличивает вероятность появления новых болезней, которые передаются от животных.

Более того, развитое транспортное сообщение между самыми отдаленными регионами ускоряет распространение этих болезней по всему миру, а люди, живущие в северных широтах, могут легко заразиться тропическими болезнями.

Угроза для всего мира вполне реальна, как бы некоторые люди ни пытались ее отрицать. Это не означает, что нужно паниковать, но и недооценивать опасность и не принимать никаких мер, продолжая бездумно эксплуатировать природные ресурсы, тоже нельзя.

Приложение — Коммерсантъ Здравоохранение (126397)

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), на Земле насчитывается более 1,2 тыс. инфекционных заболеваний. Смертность от них составляет четвертую часть всех смертей в мире, а в развивающихся странах — почти половину. Ежегодно инфекции подхватывают сотни миллионов человек, десятки миллионов погибают. Каждый час инфекции убивают 1,5 тыс. человек, из которых больше половины — дети.

Спутники человека

Инфекционные болезни — вечные спутники людей. С древнейших времен на человечество обрушивались опустошительные эпидемии и пандемии оспы, чумы, холеры, смертоносного гриппа, туберкулеза, лихорадки, малярии, полиомиелита и др. Возникая внезапно, свирепствовали годами, выкашивая города, опустошая страны, так же внезапно исчезали, чтобы возвращаться вновь и вновь, собирая новые жертвы.

С изобретением микроскопа стало понятно, что причина эпидемий — микроскопические организмы: бактерии, вирусы, грибки, риккетсии, прионы. Опасность для человека представляет лишь 1/30 000 часть огромного царства микробов, населяющих планету. Их переносят домашние и дикие животные, грызуны, насекомые. Попав в человеческий организм, одни микроорганизмы погибают, а другие, пытаясь приспособиться, мутируют и начинают передаваться от человека человеку.

В зависимости от способа передачи и области поражения организма инфекционные заболевания делятся на пять основных групп: кишечные (брюшной тиф, холера, дизентерия, сальмонеллез), респираторные (грипп, ветряная оспа, туберкулез, ОРВИ), кожные (рожа, чесотка, столбняк), кровяные (ВИЧ-инфекция, гепатит С, малярия, сыпной тиф, гемморагические лихорадки) и с множественными путями передачи (энтеровирусные инфекции, сибирская язва).

В зависимости от возбудителя различают бактериальные, вирусные и грибковые инфекции, среди которых есть болезни, присущие только людям (антропонозы), а есть инфекции, циркулирующие в организме животных, но передающиеся человеку (зоонозы). К инфекционным относят и паразитарные болезни, вызванные насекомыми и простейшими.

Наиболее смертоносные инфекционные заболевания с высокой заразностью, быстрым развитием и распространением, тяжелым течением и высокой летальностью выделены в группу особо опасных, «карантинных» инфекций, представляющих исключительную эпидемическую опасность. В эту группу входят: натуральная оспа, холера, легочная чума, желтая лихорадка и сходные с ней лихорадки Марбурга, Эбола и др.

Вечно живые

Натуральная оспа — одна из самых заразных инфекций с тяжелым течением, лихорадкой и сыпью на коже, которая переходит в язвы, оставляющие после себя рубцы. Болезнь вызывают два вида вирусов — Variola major и Variola minor. Летальность «мажора» доходит до 90%, «минора» — всего 1–3%. Переболевшие оспой приобретают стойкий иммунитет. В XX веке оспа забрала, по разным подсчетам, от 300 млн до 500 млн жизней. Массовая вакцинация привела к ликвидации оспы и спасла мир от опустошительных эпидемий. Летом 1978 года зафиксирован последний случай оспы. Это стало первой и пока единственной победой человека над микромиром. В 1981 году ВОЗ исключила натуральную оспу из перечня особо опасных болезней, но в 2005-м снова вернула ее в этот перечень, поскольку вирус натуральной оспы остался в арсенале биологического оружия ряда стран, к тому же была выявлена оспа обезьян, имеющая тяжелое течение и высокую смертность, которая рано или поздно может передаться человеку.

Не менее опасна холера, которая ежедневно убивает 395 человек. По данным ВОЗ, ежегодно в 53 странах фиксируется от 3 млн до 5 млн случаев холеры, из них более 100 тыс.— с летальным исходом. Очаги заражения находятся в Индии, Африке, Юго-Восточной Азии и Южной Америке. Инфекционный агент — холерный вибрион (вид грамотрицательных бактерий) — вызывает острейшее воспаление желудка и кишечника. Летальность без лечения — 10–80%. Для предупреждения холеры применяются два вида вакцин, уровень защиты — 50% в течение двух лет.

Мир не раз сотрясали эпидемии гриппа, который свирепствовал и в античной, и в средневековой Европе. Вспышки гриппа происходили практически ежегодно, однако всемирные пандемии случались раз в 20–30 лет: в 1490, 1510, 1535, 1556–1560, 1580, 1675, 1729, 1742–1743, 1780, 1831, 1857, 1874–1875 годах. От масштабных пандемий гриппа в Европе умирал каждый пятый. В 1918 году разразилась небывалая по смертности пандемия гриппа, унесшая больше жизней, чем Первая мировая война. Грипп тогда вспыхнул в Китае, пересек океан и стал косить население США, после чего достиг Европы, где получил название «испанская лихорадка». На смену первой волне, за год обошедшей весь мир, пришли вторая и третья. «Испанка» уничтожила от 20 млн до 50 млн человек — 2,5% жителей Земли. Болезнь развивалась молниеносно и убивала за несколько часов: если она настигала в полдень, до вечера больной не доживал. Те, кто не умирал в первый день, зачастую погибали в течение следующих суток от тяжелейшей пневмонии. За два года «испанка» поразила почти 30% населения Земли — около 500 млн человек, но, как ни странно, только взрослых, активных людей, мужчин и женщин, пощадив стариков и детей. В 1957–1958 годах от очередной пандемии гриппа (h3N2) погибли от 1 млн до 4 млн человек. Гриппом переболело от 20% до 50% земной популяции, чаще заболевали дети. Вспышку гриппа 1968–1969 годов вызвал вирус h4N2. Очагом эпидемии был Гонконг. Вирус разошелся по миру и унес около 4 млн жизней.

Одним из самых смертоносных заболеваний по-прежнему остается чума. Основным очагом инфекции считается провинция Итури в Конго (около 1 тыс. случаев в год). Вспышки чумы ежегодно регистрируются во Вьетнаме, Монголии, Китае, Казахстане, Конго, на Мадагаскаре, в Танзании, а также в США и Перу. Болезнь может протекать в кожной, легочной или кишечной формах. Инфекционный агент — чумная палочка (вид грамотрицательных бактерий). Источники заражения — крысы, суслики, верблюды, а переносчики — блохи. Инфекция стремительно распространяется по организму и сопровождается сильнейшей интоксикацией, поражением сердечно-сосудистой системы, кожными язвами, иногда пневмонией. Особенно опасна легочная чума: смертность без лечения достигает 100%. При бубонной чуме без лечения погибают 95% больных. При лечении смертность варьирует от 5% до 10%.

Среди особо опасных заболеваний отдельное место занимают тропические лихорадки.

Малярия (болотная лихорадка) на пятом месте среди инфекционных болезней по числу смертельных исходов. От нее умерли Чингисхан, Александр Македонский, пять римских пап, поэт Данте Алигьери, Карл V, Христофор Колумб, лорд Байрон и другие. Болезнь вызывается паразитическими протистами при укусах самками «малярийных» комаров и сопровождается ознобом, лихорадкой и анемией. В 2019 году от малярии в тропиках умерло больше народу, чем от любого другого заболевания. Ежедневно она убивает 2002 человека в мире. Малярией ежегодно заражаются 124–283 млн человек, погибают 367–755 тыс. Болезнь распространена более чем в 100 странах, где проживает больше половины населения Земли. Иммунный ответ у переболевших развивается медленно и практически не защищает от повторного заражения. Эффективность вакцины против малярии крайне низка (31−56%). Ежегодно в ряде регионов и крупных городов России, в том числе в Москве и Московской области, фиксируется до 500 случаев малярии.

Желтая лихорадка (амариллез) — острое геморрагическое вирусное заболевание, которое вспыхивает в сезон дождей, передается с укусом комаров и убивает 82 человека в день. Ежегодно в мире тяжелой формой желтой лихорадки заболевают 84–170 тыс. человек, погибают 29–60 тыс. Летальность — от 5% до 20%, во время эпидемий достигает 50–60%. В группе риска 47 стран.

Геморрагическая лихорадка Марбург («болезнь зеленых мартышек») — острое вирусное заболевание с тяжелым течением, высокой летальностью, геморрагическим синдромом, поражением печени, ЖКТ и ЦНС — впервые зафиксирована в 1967 году в Марбурге, Франкфурте-на-Майне и Белграде. Летальность заболевания — 50–90%. Не лечится, эффективных противовирусных препаратов нет.

Лихорадка Эбола впервые появилась в 1976 году в Заире (ныне Демократическая Республика Конго). Носители вируса Эбола — летучие мыши. Инфекция передается через повреждения на коже и слизистые оболочки. Болезнь сопровождается желтухой, лихорадкой, почечной недостаточностью и геморрагическим синдромом. Смертность достигает 90%. В 2019 году в ходе конголезской эпидемии были проведены клинические испытания двух экспериментальных лекарств, одно из которых снижает смертность от лихорадки Эбола на 27–50%, другое — на 34%. При раннем применении выживаемость больных достигает 90%.

К забытым экзотическим болезням несправедливо причислена проказа (лепра) — хроническое инфекционное заболевание, протекающее с поражением кожи, периферических нервов, верхних дыхательных путей, кистей и стоп. Инфекционный агент — микобактерии — передается респираторным путем при контактах с инфицированными. Для изоляции больных использовались лепрозории. В начале ХХI века в мире насчитывалось около 15 млн больных проказой, среди них более 2 млн инвалидов. Наблюдается ежегодный прирост новых случаев заболевания: в 2000 году — 738 тыс., в 2001-м — 775 тыс., в 2015-м — 211 973. Сейчас лидер по числу прокаженных — Индия, на втором месте — Бразилия, на третьем — Бирма. На долю этих стран приходится 70% заболевших. Эндемичные очаги заражения лепрой выявлены в 91 стране мира. В 2020 году в России зафиксировано 202 больных лепрой, при этом выявлен только один случай заражения.

Еще одна болезнь, о которой уже стали забывать,— полиомиелит (детский паралич), острое инфекционное заболевание, вызванное полиовирусом, поражающим спинной мозг. Обычно протекает бессимптомно, но иногда с парезами и параличами. До создания вакцины полиомиелит был распространен повсеместно, но сейчас он не ликвидирован лишь в Афганистане и Пакистане, где выявлено множество районов возможной передачи вируса не охваченным вакцинацией группам населения. В России последние случаи полиомиелита отмечены в 2010 году: 14 заболевших в Дагестане, Чечне, Москве и Иркутской области заразились от детей из Таджикистана. Предыдущая вспышка была в 1997 году в Чечне.

Скрытая угроза

Среди главных инфекционных «киллеров» ХХI века с большим отрывом лидирует туберкулез, ежедневно убивающий 4,5 тыс. человек. В 2019 году в мире зафиксировано 10 млн новых случаев туберкулеза, умерли 1,5 млн человек. Возбудитель заболевания — микобактерия палочка Коха — в основном поражает легкие, но иногда и другие органы и системы. Палочкой Коха инфицирована треть населения Земли. Каждый день в мире туберкулезом заболевают 30 тыс. человек. Каждую секунду возникает новый случай заболевания. Инфекция передается воздушно-капельным путем. Обычно туберкулез протекает бессимптомно, но в 10% случаев переходит в активную форму. В азиатских и африканских странах инфицировано 80% населения, в США — 5–10%. В структуре смертности от инфекционных и паразитарных заболеваний в России доля умерших от туберкулеза составляет 70%. На 2019 год Россия входит в первую двадцатку стран с наибольшим распространением туберкулеза и в первую тройку стран по числу случаев туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, который несет особую угрозу миру.

Вторую строку в рейтинге инфекций, убивающих наибольшее количество людей, занимает гепатит В. В мире от него ежедневно умирают 2430 человек. По оценкам ВОЗ, около 2 млрд людей инфицированы вирусом гепатита В, более 350 млн больны. Возбудитель заболевания проникает в кровь и поражает клетки печени — гепатоциты. Зараженные гепатоциты становятся мишенью иммунных клеток организма, массово гибнут, что приводит к нарушению детоксикационной функции печени и оттоку желчи. Вирус гепатита В в 50–100 раз заразнее ВИЧ (вируса иммунодефицита человека). Оптимальный способ защиты от заражения — вакцина от гепатита В.

Третье место по смертности среди инфекционных заболеваний в мире удерживает пневмония — воспаление легочной ткани бактериального или вирусного происхождения, убивающая ежедневно 2216 человек. Ежегодно пневмония поражает более 17 млн человек, среди которых мужчин на 30% больше, чем женщин. При этом летальность у мужчин — 8,4%, а у женщин — 9,07%. В группе риска — дети до 5 лет и люди старше 65 лет. Ежегодно в мире от пневмонии умирают 15% детей до 5 лет. Заболеваемость пневмонией среди призывников весьма высока — 35–40 случаев на 1 тыс. человек, при этом 10% случаев протекают достаточно тяжело. Основу лечения пневмонии составляют антибиотики. В качестве профилактики применяется вакцина от пневмококковой инфекции.

Четвертую строку в списке занимает ВИЧ, ежедневно уносящий 2210 человеческих жизней. Вирус иммунодефицита поражает клетки иммунной системы и угнетает ее, в результате чего развивается синдром приобретенного иммунного дефицита (СПИД). Организм больного теряет способность защищаться от вторичных инфекций и опухолей. Без лечения через 9–11 лет после заражения наступает смерть пациента. На стадии СПИДа средняя продолжительность жизни пациента не превышает девяти месяцев. Ежегодно в мире ВИЧ заражаются около 2 млн человек. В мире число людей с ВИЧ составляет около 40 млн человек, в России — более 1,3 млн человек. Сегодня благодаря дорогостоящей антиретровирусной терапии качество и продолжительность жизни ВИЧ-инфицированных находятся на приемлемом уровне — практически таком же, как у других людей. Однако антиретровирусную терапию получают меньше трети нуждающихся в ней россиян.

С 2005 года список особо опасных инфекций ВОЗ был дополнен отдельной группой, включающей малоизученные «необычные болезни»: новые подтипы гриппа и тяжелый острый респираторный синдром. К особо опасным болезням относится птичий грипп (H5N1) — острое вирусное заболевание птиц и людей, вызывающее поражение дыхательной и пищеварительной систем, способное передаваться от птиц человеку. В 2009 году Мексику и США поразил доселе неизвестный вирус свиного гриппа (h2N1), распространившийся сначала среди домашних свиней, который передавался человеку. Инфекция вызывала типичные для ОРВИ симптомы, но осложнялась пневмонией. Заметная вспышка вируса h2N1 случилась в 2009–2010 годах. Пандемия охватила 30% населения в 214 странах мира, погибли более 18 тыс. человек. К одному из видов свиного гриппа причисляют упомянутую «испанку».

Среди малоизученных «необычных болезней» особо выделяют тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС), атипичная пневмония. Возбудитель болезни — коронавирус SARS-CoV. ТОРС начинается с температуры, лихорадки, озноба, головной и мышечных болей. Летальность заболевания — около 10%, у пациентов старше 50 лет — около 50%. Источником вируса SARS-CoV считаются подковоносные летучие мыши из пещер китайской провинции Юньнань. Первый случай заражения ТОРС выявлен в 2002 году в Южном Китае, после чего заболевание многократно фиксировали во Вьетнаме, Индонезии, Китае, Новой Зеландии, Таиланде и на Филиппинах, в Европе и Северной Америке. По данным ВОЗ, за время вспышки 2002–2003 годов в 37 странах мира число инфицированных составило 8437, скончались более 800 человек. Эффективного лечения ТОРС не найдено. При нарастании дыхательной недостаточности больных подключают к ИВЛ.

Ближневосточный респираторный синдром — тяжелое воспалительное заболевание органов дыхания, вызываемое коронавирусом MERS-CoV, начинается с температуры, лихорадки, кашля, одышки и переходит в тяжелую вирусную пневмонию, иногда с почечной недостаточностью. Первый случай заражения MERS-CoV был зафиксирован осенью 2012 года в Саудовской Аравии, а позже в других странах Ближнего Востока. Смертность — 35–40%. Природный резервуар вируса — популяция летучих мышей, но антитела к MERS-CoV выявляются и у верблюдов. Возможна передача вируса от человека к человеку. Вакцины и лекарства отсутствуют. При лечении используется плазма крови переболевших.

Светлана Белостоцкая


Вирус герпеса 6 типа (качественное определение ДНК)

Вирус герпеса 6 типа,  называемый ещё HHV-6 – инфекция, не менее распространённая в мире, чем вирусы герпеса 1 и 2 типов. Вирус имеет 2 подтипа – А и В, подтип В  является основной причиной внезапной экзантемы (детской розеолы), одной из детских инфекций, протекающей с высокой температурой и сыпью.

Для  вируса герпеса 6 типа  характерны те же особенности, как для других типов герпесвируса: пожизненное и часто бессимптомное носительство. Отличительной особенностью этого вируса является выраженное проявление у детей. Сегодня учёные считают, что наиболее часто этот вирус передаётся через слюну, и потому маленькие дети инфицируются  этим вирусом почти  с первых дней контакта с матерью или другими людьми, являющимися переносчиками вируса.

Однако в первые несколько месяцев жизни заражение ребёнка вирусом герпеса 6 типа не приводит ни к каким последствиям: переданный от матери врождённый иммунитет уверенно подавляет вирусные частицы. Только в том случае, если этого вируса у матери нет, а ребёнок заражается от другого человека, типичные симптомы герпеса 6 типа могут возникнуть у младенца уже с первых  месяцев  жизни. Обычно же герпесом дети переболевают в возрасте от 4 до 13 месяцев. Если вирус герпеса 6 типа попадает во взрослый организм впервые, он вызывает примерно те же симптомы, что и у детей: лихорадку и высыпания на коже.

Основной путь передачи вируса герпеса 6 типа – контактный.  Редко регистрируется передача вируса от матери ребёнку непосредственно во время родов. В результате проведенных исследований выяснилось, что у 2% рожениц вирус герпеса присутствует в вагинальном секрете, а ещё у 1% – в крови в пуповине. Не удивительно, что при родах герпес легко может попасть в организм ребёнка через микротравмы и царапины.

Главным симптомом заболевания, вызываемого вирусом герпеса 6 типа, являются обширные мелкие высыпания на коже у ребёнка, которые часто именуют детской розеолой.  По всему телу ребёнка распространяются небольшие высыпания, немного приподнятые над кожей и обычно не вызывающие зуда.

Всегда за несколько дней до появления высыпаний у ребёнка наблюдается повышение температуры, характерное для лихорадки. Однако даже при такой температуре тела ребёнок сохраняет активность. Высокая температура держится в течение 4-5 дней, после чего резко падает и ребёнка обсыпает.

Случается, что болезнь протекает без высыпаний

Если же высыпания у ребёнка появились, то держатся они на коже недолго: в некоторых случаях они проходят уже через несколько часов, иногда же могут сохраняться в течение нескольких дней. Параллельно с ними у ребёнка пропадает аппетит, он становится малоподвижным и раздражительным, иногда у него происходит увеличение лимфатических узлов.

Более серьёзными проявлениями первичного заражения герпесом 6 типа являются:

  • менингоэнцефалиты
  • миокардит
  • фульминантный гепатит
  • тромбоцитопеническая пурпупа
  • мононуклеозоподобный синдром
  • различные пневмонии.

Очень важно помнить, что сам герпес зачастую проявляется в качестве спутника других заболеваний.

Диагностика инфекции, вызванной основывается вирусом герпеса 6 типа, основана на определении ДНК вируса и определении антител класса G. В популяции взрослых людей IgG антитела к данному вирусу выявляются у 70 — 90% людей. IgG-антитела появляются на 7-й день лихорадки, достигая максимума через 2 — 3 недели, далее их концентрация снижается, но определяются они на протяжении всей жизни. При рождении в крови детей могут обнаруживаться материнские IgG-антитела, титр которых снижается к 5 месяцам.

После перенесения в детстве заболевания, вызванного вирусом герпеса типа 6, организм вырабатывает пожизненный иммунитет, и у взрослых HHV-6 сам по себе никак не проявляется. Несмотря на то, что он достаточно часто переживает рецидив, когда с помощью анализа крови можно определить его наличие в организме, у людей с нормальным иммунитетом такие рецидивы происходят бессимптомно.

ВыявлВыявление ДНК с помощью ПЦР в режиме «реал-тайм» возможно уже  с первых дней заболевания. Исследуют соскоб эпителиальных клеток с задней стенки глотки или кровь. При реактивации инфекции обнаружение ДНК случит диагностическим подтверждающим маркером.

Показания к исследованию:

  • Дифференциальная диагностика детских инфекций, сопровождающихся лихорадкой и пятнисто-папулезной сыпью
  • Увеличение лимфатических узлов, сопровождающееся лихорадкой
  • Часто болеющие дети (более 3 раз в год)
  • Снижение иммунитета
  • Обследование до и после трансплантации тканей и органов

«Ветряночные вечеринки — не альтернатива вакцинации». Педиатр — о том, почему ветрянка вовсе не «лёгкая» болезнь

29 января первый заместитель министра здравоохранения Татьяна Яковлева сообщила, что в национальный календарь прививок планируют включить вакцинацию от ротавирусов, ВПЧ и ветряной оспы. О последней мы поговорили с немецким педиатром Фолькером Феттером, который участвовал в испытании подобной вакцины у себя на родине. Он рассказал, так ли необходима обязательная прививка от ветрянки и чем вообще может быть опасна эта «лёгкая» детская болезнь.

Полезная рассылка «Мела» два раза в неделю: во вторник и пятницу

Что такое ветрянка и что в ней плохого

Разве ветрянка опасна?

По статистике, ветрянка была примерно у 95% взрослого населения Земли. И у большинства она действительно протекала без осложнений: только 5% больных требовалась госпитализация. Но если учитывать, что ветрянка бывает почти у каждого человека, те самые 5% превращаются в довольно существенную цифру.

Какие осложнения могут быть у ветрянки?

Бактериальная инфекция кожи, пневмония, энцефалит, даже инсульт. Причем последние три диагноза могут иметь летальный исход. Ученые пока не выяснили, почему в детском возрасте ветрянка протекает легче, но, по статистике, среди детей осложнения получает 1 из 100 тысяч, в подростковом возрасте — 1 из 50 тысяч, а во взрослом — 1 из 4 тысяч человек.

Для людей с иммунодефицитом, диабетом, онкологическими заболеваниями, для стариков и беременных женщин, не болевших ветрянкой и не привитых от неё, заражение этой болезнью может представлять серьёзную (порой даже смертельную) опасность.

Кадр из мультсериала «Симпсоны»

Кроме того, у переболевших ветрянкой вирус останется в организме навсегда, при снижении иммунитета и особенно в пожилом возрасте он может вызвать опоясывающий герпес. Это довольно неприятное состояние, осложнением которого может стать поражение глаз или даже паралич.

Заразиться можно только через прямой контакт с больным?

Не обязательно. Ветрянка — высококонтагиозное заболевание, которое передается воздушно-капельным путем, в том числе, например, через вентиляцию.

Если вы летите в самолете и один из пассажиров болен ветрянкой, то заражение вполне можно гарантировать всем, у кого нет антител к этой болезни. Именно поэтому заболевших отправляют на карантин: сами они могут чувствовать себя вполне нормально, но при этом представляют серьёзную опасность для людей из групп риска.

Кстати, заразившийся человек может стать переносчиком болезни ещё до появления первых симптомов, так что контролировать процесс распространения болезни довольно сложно.

А можно переболеть ветрянкой и не заметить этого?

Да, такое тоже случается: вы можете просто получить небольшую «дозу» вируса, и тогда это будет сродни вакцинации. Организм выработает антитела, но сама болезнь пройдет практически незаметно. Однако после болезни человек имеет высокие шансы при снижении иммунитета заболеть опоясывающим герпесом. После вакцинации такие риски сведены к минимуму.

Профилактика: как не заразиться и что делать при контакте с больным

Не проще ли переболеть ветрянкой в детском возрасте?

Нет. Даже в неосложненной форме это все равно болезнь — с зудящей сыпью (она может поражать в том числе слизистую глаз, половые органы и т. д.), часто с лихорадкой, длительным периодом изоляции, вероятностью рубцов на коже, снижением иммунитета после болезни.

Отводя детей на так называемые ветряночные вечеринки, родители считают, что минимизируют риски: заражают здорового ребёнка в удобное им самим время. Но альтернативой вакцинации этот метод всё равно считать нельзя. Потому что от прививки болезнь не развивается и человек не становится опасным для окружающих.

Заболевший ребёнок, помимо плохого самочувствия, может передать вирус другим — в том числе и тем людям, для которых он станет фатальным. Или может сам получить осложнение в виде ветряночной пневмонии, энцефалита и так далее — от этого никто не застрахован. От прививки таких осложнений не бывает.

Кадр из мультсериала «Симпсоны»

Что собой представляет прививка от ветрянки? От нее могут быть осложнения?

Вакцина от ветрянки — это ослабленный вирус herpes zoster, который и вызывает болезнь. Это так называемая живая вакцина. Такой вирус всё ещё может заразить пациента, но уже не вызывает заболевания или провоцирует его лишь в максимально легкой форме, чтобы заставить иммунную систему среагировать. То есть полностью повторяет биологические процессы — у человека вырабатывается иммунитет от болезни, но без рисков для здоровья.

У вакцины от ветрянки очень хорошие показатели безопасности. С 1984 года, года изобретения вакцины, побочных эффектов от неё зафиксировано не было

После вакцинации могут случиться незначительные нежелательные явления, например покраснение в месте укола или небольшое повышение температуры. Также в редких случаях может наблюдаться характерная для классической ветрянки небольшая сыпь.

В каком возрасте нужно делать эту прививку?

В отличие от Германии, Греции, США и других стран, в России прививка от ветрянки пока не включена в национальный календарь. Но делать её можно после первого года жизни. Вакцинация выполняется дважды — с интервалом минимум в шесть недель у детей и в один месяц у подростков старше 13 лет и взрослых. Защиту можно считать эффективной только после второй дозы вакцины. Одна доза защищает от болезни примерно на 70%, а от осложнений, если они всё же случаются, уже на 95%.

Привитый живой вакциной человек опасен для окружающих?

Нет. Правда, сразу после и в течение нескольких дней после вакцинации лучше не контактировать с беременными женщинами, людьми с иммунодефицитом и другими представителями групп риска, хотя и в этом случае вероятность заражения крайне невысока. Если же у человека после прививки возникла сыпь, то рекомендуется ограничить контакт с другими людьми до её исчезновения.

Что делать, если я или ребёнок оказались в контакте с больным ветрянкой?

Если вы ранее не болели ею или не прививались, то для предотвращения болезни нужно срочно сделать прививку. В идеале — в течение 72 часов после контакта, но допустим также срок и в первые пять суток.

Я взрослый и не помню, болел ли ветрянкой. Мне нужна прививка?

Можно сдать анализ крови на антитела IgG к ветряной оспе. Если они есть — все в порядке, болезнь вам не страшна. Если же нет, можно сделать прививку. Вакцинация особо рекомендуется взрослым, которые работают с детьми или часто бывают в местах большого скопления людей, женщинам, планирующим беременность, людям с серьёзными хроническими заболеваниями (диабет, иммунодефицитные состояния, сердечная недостаточность и т. д.).

Вакцинация также рекомендуется тем, кто недавно проходил лучевую либо химиотерапию: заражение для этой группы людей может иметь крайне тяжелые последствия. Но перед прививкой важно проконсультироваться с врачом: состояние пациента должно быть нормальным, без обострений.

Лечение: что делать, если человек уже заболел

Если ветрянка все же случилась, как ее правильно лечить?

Прижигать сыпь зеленкой или марганцовкой доказательные врачи не рекомендуют. Снять зуд и предотвратить бактериальные инфекции кожи помогут более современные средства, например, лосьоны на основе цинка.

Жаропонижающие на основе парацетамола (применять ибупрофен и аспирин при ветрянке не рекомендуют), обильное питье, постельный режим — все это также применяется при наличии соответствующих симптомов (лихорадка, интоксикация, слабость).

Кроме того, всем, кто был в контакте с заболевшим и не знает, болел ли он ветрянкой, следует срочно сдать кровь на антитела IgG к ветряной оспе и при их отсутствии сделать прививку. Это либо убережет от болезни, либо сделает её течение максимально легким.

Кадр из мультсериала «Симпсоны»

Можно ли мыться при ветрянке?

Да, более того, все международные руководства по лечению ветрянки рекомендуют это делать. Принимать душ лучше даже несколько раз в день: это помогает снизить кожный зуд и предотвратить инфекции. Главное — не тереть кожу мочалкой и, если пользуетесь гелем для душа, отдать предпочтение гипоаллергенным вариантам.

Когда человек перестает быть заразным?

Инкубационный период болезни длится, как правило, одну-три недели. Причем последние один-три дня этого срока человек уже может быть заразным (хотя сыпи у него еще нет).

Высыпания обычно продолжаются 3–10 дней, причем человек остается заразным и после их исчезновения. Распространение вируса прекращается лишь через 5–7 дней у детей (и примерно через 10 дней у взрослых) после появления последних высыпаний.

Специалисты рекомендуют тверитянам сделать прививки от кори

Исчезнувшая болезнь вернулась в Россию. Восемь случаев заболевания корью зарегистрировано в Тверской области.

Забытые болезни возвращаются. Корь, ветрянка, паротит — считаются «детскими». Однако осложнения у них — совсем не «детские». Опасную инфекцию могут прихватить и взрослые, у которых нет нужных инфекций.

Заболеть корью в 6 раз проще, чем гриппом. Осложнения — серьезнее, вплоть до летального исхода. Исчезнувшая болезнь вернулась в Россию. По данным Роспотребнадзора, две с половиной тысячи человек подхватили эту инфекцию в прошлом году. В этом — около 900 жителей Москвы и Подмосковья. Восемь случаев зарегистрировано в Тверской области. Переносчики кори — чаще всего трудовые мигранты из тех стран, где отказались от прививок. Массовых эпидемий удается избежать, россияне привиты от этой инфекции еще в раннем детстве. Однако иммунитет приобретается не до конца жизни.

«У разных видов вакцин продолжительность поствакцинального иммунитета от 8-10 лет до 20 лет. Поэтому ревакцинация нужна, тем более, когда не благоприятная эпидемиологическая ситуация, как сейчас сложилась во многих странах. Здесь ревакцинируют всех по контакту, кто был ранее не вакцинирован или не имеет сведения, не болевшие», — рассказала Наталья Киселёва, ассистент кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Тверского медицинского университета.

Чтобы выяснить, нужна ли повторная прививка от кори, взрослые люди могут обратиться в поликлиники к терапевтам по месту жительства и сдать анализ крови на наличие антител к инфекциям. Вакцинация — бесплатная. В Тверском регионе вакцины — в достаточном количестве. Не только методы профилактики корью обсуждали инфекционисты со всей области на конференции в Тверском медицинском университете, а также других заболеваний. Совсем скоро горожане отправятся на дачи, любители путешествий — в экзотические страны. Там их может поджидать опасность, а именно такие инфекции, как сальмонеллез и дизентерия. Вирусы не одолеют, если знать простые правила.

«Не пить сырую воду, где попало. И мыть фрукты с мылом, как ни странно, с мылом, потому что на поверхности фруктов возбудители кишечных инфекций хорошо сохраняются», — отметил Виктор Макаров, заведующий кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии Тверского медицинского университета.

Кишечной инфекцией можно заболеть и дома. Часто хозяйки не соблюдают технологию приготовления домашних солений. Токсина ботулизма накапливаются за полгода. Шанс съесть такие маринованные огурцы и оказаться в лучшем случае на больничной койке — велика, предупреждают врачи.

Татьяна Корсунова Олег Сурин Вести

Педиатр Инна Фроландина: «Риск развития заболеваний у лицеистов и гимназистов выше, чем у обычных школьников»

Педиатр Инна Фроландина

— Инна Петровна, как современные мамы и папы относятся к здоровью своих детей?

— Конечно же, как и во все времена, трепетно. Но если раньше они безоговорочно доверяли своему доктору, то сегодня у наших родителей довольно богатый арсенал источников: различные интернет-сайты, социальные сети, печатные издания, из которых мамы и папы черпают всевозможную информацию, иногда, к сожалению, непрофессионально её интерпретируя. Зачастую приходя на приём в поликлинику, родители сами якобы чётко знают, какое лечение необходимо назначить их ребёнку, порой даже дают советы врачу.

— Разве это правильно?

— Можно приветствовать интерес родителей, которые полученную информацию используют на пользу себе и своим детям, но при этом консультируются со специалистами.

— Возможно ли самолечение и в каких случаях?

— При появлении каких-то симптомов заболевания лучше обратиться за медицинской помощью. Но практически каждая мама знает, как можно облегчить состояние ребёнка до прихода врача. Снижать температуру рекомендуется в крайних случаях, если она выше 38,5 С и есть сопутствующие заболевания сердца и лёгких, склонность к судорогам, а также в возраст до трёх месяцев. При заложенности носа сосудосуживающие капли рекомендуется применять не более трёх дней. При покраснении горла поможет полоскание настойками трав: ромашкой, календулой. А вот с болью в горле лучше сразу обратиться к врачу, чтобы исключить более серьёзные заболевания. Не рекомендуется самостоятельно экспериментировать с лекарствами от кашля. Средства народной медицины при простуде лишними не будут, но делать на них ставку не стоит. Ещё среди родителей бытует мнение, что ребёнку лучше таблетки не давать. Но не будем забывать, что именно благодаря современным фармацевтическим препаратам мы живём не двадцать-тридцать лет, как первобытные люди, а гораздо дольше.

— Чем чаще всего болеют дети?

— Если говорить об острых заболеваниях, то здесь лидирующие позиции среди всех возрастных групп занимают болезни органов дыхания. У подростков — на первом месте болезни органов пищеварения. Далее следуют болезни костно-мышечной системы, глаз и эндокринной системы. В последние годы отмечается снижение заболеваемости детей до одного года. Современная медицина располагает большими диагностическими возможностями.

Педиатр Инна Фроландина

— Ребёнок пошел в школу, и начинаются проблемы со здоровьем?

-Модернизация системы образования, связанная с усилением учебных нагрузок, использованием новых педагогических технологий без учёта физических и психологических возможностей детского организма, психоэмоциональный дискомфорт, школьный стресс, низкая двигательная активность, конечно же, негативно отражаются на состоянии здоровья учащихся. Среди «школьных» заболеваний лидируют: нарушения зрения, осанки, деформации позвоночника, стопы, нарушения физического развития, заболевания органов пищеварения, психосоматические расстройства и другие. Итоги профилактических осмотров показывают нам, что учащиеся специализированных образовательных учреждений — гимназий и лицеев – в большей степени подвержены развитию различных нарушений здоровья и заболеваний.

— Что врачи могут сказать по поводу чрезмерного увлечения гаджетами среди детей и подростков?

— Если бесконтрольно и длительно пользоваться телефонами, планшетами, подолгу «зависать» в Интернете, то это всё негативным образом отражается на здоровье, прежде всего, на зрении и осанке. Из-за долгого пребывания за столом при выполнении домашних заданий, за компьютерными играми, могут появиться и головные боли, и развиться неврозоподобные состояния. Наши рекомендации — ограничить время, проводимое с гаджетами, у телевизора; чаще бывать на свежем воздухе; уделять время спорту и физическим нагрузкам.

— Как школьное питание отражается на здоровье школьников?

— Здесь есть положительные результаты благодаря реализации в школах области проекта по школьному питанию. Во всех школах — типовые столовые, практически все блюда готовятся на пару. В школьных буфетах — никаких газированных напитков и чипсов. Статистика показывает снижение процента учащихся с заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Стало меньше детей с избыточным весом. И, как показывает практика последних лет, всё больше подростков интересуется нормами рационального питания и следит за своим весом.

Педиатр Инна Фроландина

— Какие ещё заболевания распространены среди современных детей?

— Несмотря на то, что нами отмечается тенденция к уменьшению заболеваний желудочно-кишечного тракта, тем не менее, у школьников встречаются хронические гастриты, язвенная, желчнокаменная и мочекаменная болезни. Причины — не только в наследственной предрасположенности, но и в тех условиях, в которых мы живём. Здесь хотелось бы обратить внимание на культуру питания, на качество приготовляемых дома продуктов, на то, что пить лучше фильтрованную воду. Растёт количество детей, страдающих аллергическими заболеваниями.

— Инна Петровна, если зрение, осанка, желудок во многом зависят от нашего образа жизни, то, наверное, многих инфекционных заболеваний можно избежать с помощью прививок?

— Да, конечно. Целью вакцинации является создание специфической невосприимчивости организма к инфекционному заболеванию. С четвёртого дня жизни и до четырёх-пяти лет детский организм собирает максимум информации об окружающем микробном мире. Поэтому в этом возрасте прививки оказываются наиболее эффективными. Например, вакцинацию от коклюша можно делать только до трёх лет. Потом организм может бурно отреагировать на такую прививку. Кстати, от гриппа надо прививаться ежегодно, так как вирус постоянно мутирует. На сто процентов прививка не защищает нас от заболевания, но наша главная цель — не допустить тех осложнений, которыми опасен грипп.

— Тем не менее, есть родители, которые боятся делать детям прививки.

— Существует федеральный закон, который даёт право отказаться от профилактических прививок. Но родители, которые это делают, должны задуматься о праве своего собственного ребёнка на здоровье и о безопасности окружающих детей! К тому же, если объявлен карантин, то образовательное учреждение вправе отказать в приёме или временно ограничить посещение непривитого ребёнка. Противникам прививок следует знать о серьёзных последствиях, которые могут возникнуть у непривитого ребёнка после перенесённых вирусных инфекций. После кори высока вероятность развития диабета первой степени. Эпидемический паротит у мальчиков может привести к бесплодию. После полиомиелита есть вероятность того, что ребёнок станет инвалидом.

— Инна Петровна, от ветряной оспы прививают?

— На сегодняшний день вакцинация против ветряной оспы не входит в календарь профилактических прививок, по которому мы работаем, однако вакцина от ветряной оспы существует. Отличительными признаками этого заболевания является сыпь, которая появляется, прежде всего, на лице и волосистой части головы. Вирус ветряной оспы передаётся воздушно-капельным путём. От момента контакта с заболевшим, высыпания следует ждать с 11-го по 21-ый день. У взрослых «ветрянка» протекает в довольно выраженной клинической форме.

Педиатр Инна Фроландина

— Инна Петровна, на носу — летний курортный сезон. О каких опасностях надо помнить, с какого возраста лучше вывозить ребёнка?

— Всё индивидуально. Но лучше везти ребёнка на море с возраста, когда у него уже сформировались первые навыки самообслуживания: он может самостоятельно помыть руки, сходить в туалет. Возможно, что для самых маленьких лучший вариант — это привычный климат, местная зона отдыха. Если отправляетесь на море, то лучше выбрать открытое побережье, а не бухту, где наиболее высока вероятность «подхватить» кишечную инфекцию. В поездке – в поезде, в автомобиле, останавливаясь в придорожных кафе, прежде всего надо следует помнить о тщательной личной гигиене.

— Какие кишечные инфекции наиболее распространены?

— Последние годы наиболее часто встречаются — сальмонеллез, пищевые токсикоинфекции, энтеровирусная и ротавирусная инфекции. Дизентерия сейчас встречается гораздо реже, чем в прежние годы. Главные причины кишечных инфекций — немытые овощи и фрукты, испортившиеся пищевые продукты, грязные руки и предметы быта, мухи и другие насекомые, как переносчики загрязнений, купание в водоемах, используемая вода для питья и приготовления пищи и, конечно же, больной человек. Клиническими проявлениями заболеваний являются повышение температуры, интоксикация, слабость, боли в области живота, рвота, частый стул с примесью слизи, что зачастую приводит к обезвоживанию организма. Наиболее распространен сейчас ротавирусный гастроэнтерит. Им болеют люди любого возраста, но максимальная заболеваемость отмечается у детей первых двух лет жизни.

— А для оказания первой доврачебной помощи, что с собой нужно взять в дорогу?

— В вашей дорожной аптечке должны быть обязательно жаропонижающие и противоаллергические средства; ферментные препараты; адсорбенты, например такие, как смекта, энтеросгель, то есть препараты, которые связывают и выводят из желудочно-кишечного тракта токсины, патогенные микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности. Не забудьте про фурациллин, нашатырный спирт, перекись водорода, лейкопластырь, перевязочный материал, стерильные салфетки.

— Инна Петровна, наверное, работы педиатрам хватает и зимой и летом?

— Да, безусловно. На начало текущего года под наблюдением нашего учреждения состояло 21781 ребёнка от рождения до 18 лет. В структуру входят три педиатрических отделения, а это 24 педиатрических участка. Средняя численность детей на одном участке составляет 908 человек, что превышает норматив на 14 процентов. С учётом численности нашего населения, у нас должно быть 27 участка. Но в настоящее время дополнительные педиатрические участки не выделяются из-за недостаточной укомплектованности учреждения врачами-педиатрами участковыми… Так что работы хватает всегда. У нас — дети. Всякое может случиться. Сколько к нам придёт на приём — столько мы и примем.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Вирус ветряной оспы как живой вектор для экспрессии чужеродных генов.

Proc Natl Acad Sci U S. A. 1987 Jun; 84 (11): 3896–3900.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Предыдущая демонстрация эффективности и переносимости окского штамма вируса ветряной оспы (VZV) в клинических испытаниях, включающих вакцинацию как здоровых людей, так и лиц с ослабленным иммунитетом, заложила основу для его использования в профилактике ветряной оспы.В этом контексте VZV также может быть использован в качестве вектора для вакцинации против других инфекционных агентов. В качестве первоначального применения был получен живой рекомбинантный VZV, экспрессирующий мембранные гликопротеины вируса Эпштейна-Барра (EBV) (gp350 / 220) путем вставки слияния гена промотора gpI VZV и последовательности, кодирующей гидрофобный лидер, с кодирующей последовательностью gp350 / 220 в ген тимидинкиназы (TK) VZV (Oka). Вставка чужеродной ДНК в ген тимидинкиназы была продемонстрирована с помощью саузерн-блот-анализа и способности рекомбинантного вируса реплицироваться в присутствии бромдезоксиуридина.Сплайсинг РНК, гликозилирование и представление gp350 / 220 на плазматической мембране в клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом, были аналогичны тем, которые наблюдались в клетках, инфицированных EBV. Кроме того, экспрессия VZV-специфических гликопротеинов не изменялась сопутствующей экспрессией этого большого чужеродного гликопротеина. Таким образом, VZV можно использовать в качестве живого вирусного вектора для активной иммунизации против EBV и других патогенов.

Полный текст

Полный текст доступен в виде отсканированной копии оригинальной печатной версии.Получите копию для печати (файл PDF) полной статьи (1,3 Мбайт) или щелкните изображение страницы ниже, чтобы просмотреть страницу за страницей. Ссылки на PubMed также доступны для Избранные ссылки .

Изображения в этой статье

Щелкните изображение, чтобы увидеть его в увеличенном виде.

Избранные ссылки

Эти ссылки находятся в PubMed. Это может быть не полный список ссылок из этой статьи.

  • Такахаши М. Вирус ветряной оспы.Adv Virus Res. 1983; 28: 285–356. [PubMed]
  • Плоткин С.А., Арбеттер А.А., Старр С.Е. Будущее вакцины против ветряной оспы. Postgrad Med J. 1985; 61 (Приложение 4): 155–162. [PubMed]
  • Ханнгрен К., Грандиен М., Гранстрём Г. Эффект иммуноглобулина против опоясывающего лишая для профилактики ветряной оспы у новорожденных. Scand J Infect Dis. 1985. 17 (4): 343–347. [PubMed]
  • Парьяни С.Г., Арвин А.М.. Внутриутробное инфицирование вирусом ветряной оспы после ветряной оспы у матери.N Engl J Med. 1986, 12 июня; 314 (24): 1542–1546. [PubMed]
  • Фельдман С., Хьюз В.Т., Ким Х.Й. Опоясывающий герпес у онкологических детей. Am J Dis Child. 1973, август; 126 (2): 178–184. [PubMed]
  • Брунелл П.А., Тейлор-Видеман Дж., Гейзер К.Ф., Фриерсон Л., Лидик Э. Риск опоясывающего герпеса у детей с лейкемией: вакцина против ветряной оспы по сравнению с ветряной оспой в анамнезе. Педиатрия. 1986, январь, 77 (1): 53–56. [PubMed]
  • Аткинсон К., Мейерс Дж. Д., Сторб Р., Прентис Р. Л., Томас Э. Д..Инфекция вирусом ветряной оспы после трансплантации костного мозга по поводу апластической анемии или лейкемии. Трансплантация. 1980. 29 (1): 47–50. [PubMed]
  • Ruckdeschel JC, Schimpff SC, Smyth AC, Mardiney MR., Jr. Опоясывающий лишай и нарушение клеточного иммунитета к вирусу ветряной оспы у пациентов с болезнью Ходжкина. Am J Med. 1977, январь, 62 (1): 77–85. [PubMed]
  • Сухами Р.Л., Бэббидж Дж., Сигфуссон А. Нарушение производства антител in vitro к ветряной оспе и другим вирусным антигенам у пациентов с болезнью Ходжкина.Clin Exp Immunol. 1983 август; 53 (2): 297–307. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Такахаши М., Оцука Т., Окуно Ю., Асано И., Язаки Т. Живая вакцина, используемая для предотвращения распространения ветряной оспы у детей в больницах. Ланцет. 30 ноября 1974 г .; 2 (7892): 1288–1290. [PubMed]
  • Гершон А.А., Стейнберг С.П., Гельб Л., Галассо Г., Борковски В., ЛаРусса П., Фаррара А. Живая аттенуированная вакцина против ветряной оспы. Эффективность для детей с лейкемией в стадии ремиссии. ДЖАМА. 20 июля 1984 г .; 252 (3): 355–362.[PubMed]
  • Weibel RE, Neff BJ, Kuter BJ, Guess HA, Rothenberger CA, Fitzgerald AJ, Connor KA, McLean AA, Hilleman MR, Buynak EB, et al. Живая аттенуированная вакцина против вируса ветряной оспы. Испытание эффективности у здоровых детей. N Engl J Med. 31 мая 1984 г.; 310 (22): 1409–1415. [PubMed]
  • Масуччи М.Г., Сигети Р., Эрнберг И., Бьеркхольм М., Меллштедт Х., Хенле Г., Хенле В., Пирсон Г., Масуччи Г., Сведмир Е. и др. Клеточно-опосредованные иммунные реакции у трех пациентов со злокачественными лимфопролиферативными заболеваниями в стадии ремиссии и аномально высокими титрами антител к вирусу Эпштейна-Барра.Cancer Res. 1981 ноябрь; 41 (11, часть 1): 4292–4301. [PubMed]
  • Пуртило Д. Т., Сакамото К., Сэмундсен А. К., Салливан Дж. Л., Синнерхольм А. С., Анврет ​​М., Притчард Дж., Слопер С., Сифф К., Пинкотт Дж. И др. Документирование вирусной инфекции Эпштейна-Барра у пациентов с иммунодефицитом и угрожающими жизни лимфопролиферативными заболеваниями посредством клинических, вирусологических и иммунопатологических исследований. Cancer Res. 1981 ноябрь; 41 (11, часть 1): 4226–4236. [PubMed]
  • Эпштейн MA. Лекция Левенгука, 1983 г.Прототип вакцины для предотвращения опухолей, связанных с вирусом Эпштейна-Барра. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 1984 22 марта; 221 (1222): 1–20. [PubMed]
  • Клиффорд П. Обзор эпидемиологии рака носоглотки. Int J Cancer. 1970 15 мая; 5 (3): 287–309. [PubMed]
  • Эпштейн MA. Вирус Эпштейна-Барра — пора ли разработать программу вакцинации? J Natl Cancer Inst. 1976, апрель; 56 (4): 697–700. [PubMed]
  • Mackett M, Arrand JR. Рекомбинантный вирус осповакцины индуцирует нейтрализующие антитела у кроликов против мембранного антигена gp340 вируса Эпштейна-Барра.EMBO J. 1 декабря 1985 г .; 4 (12): 3229–3234. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Beisel C, Tanner J, Matsuo T, Thorley-Lawson D, Kezdy F, Kieff E. Два основных гликопротеина внешней оболочки вируса Эпштейна-Барра кодируются одним и тем же геном . J Virol. 1985 июнь; 54 (3): 665–674. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Эдсон К.М., Торли-Лоусон, Д.А. Синтез и обработка трех основных гликопротеинов оболочки вируса Эпштейна-Барра. J Virol. 1983 Май; 46 (2): 547–556. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Hoffman GJ, Lazarowitz SG, Hayward SD.Моноклональные антитела против гликопротеина вируса Эпштейна-Барра в 250 000 дальтон идентифицируют мембранный антиген и нейтрализующий антиген. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1980 May; 77 (5): 2979–2983. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Thorley-Lawson DA, Poodry CA. Идентификация и выделение основного компонента (gp350-gp220) вируса Эпштейна-Барра, ответственного за образование нейтрализующих антител in vivo. J Virol. 1982 август; 43 (2): 730–736. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Jacobs JP, Jones CM, Baille JP.Характеристики диплоидной клетки человека, обозначенной MRC-5. Природа. 11 июля 1970 г .; 227 (5254): 168–170. [PubMed]
  • Дэвисон А. Дж., Скотт Дж. Э. Полная последовательность ДНК вируса ветряной оспы. J Gen Virol. 1986 сентябрь; 67 (Pt 9): 1759–1816. [PubMed]
  • Сойер MH, Острове JM, Felser JM, Straus SE. Картирование гена дезоксипиримидинкиназы вируса ветряной оспы и предварительная идентификация его транскрипта. Вирусология. 1986 Февраль; 149 (1): 1–9. [PubMed]
  • Дэвисон А. Дж., Скотт Дж. Э.Молекулярное клонирование генома вируса ветряной оспы и получение шести карт рестрикционных эндонуклеаз. J Gen Virol. 1983 август; 64 (Pt 8): 1811–1814. [PubMed]
  • Лоуи Д. Р., Рэндс Э., Сколник Е. М.. Хелпер-независимая трансформация неинтегрированной ДНК вируса саркомы Харви. J Virol. 1978 Май; 26 (2): 291–298. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Straus SE, Aulakh HS, Ruyechan W.T., Hay J, Casey TA, Vande Woude GF, Owens J, Smith HA. Структура ДНК вируса ветряной оспы.J Virol. Ноябрь 1981 г., 40 (2): 516–525. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Торли-Лоусон Д.А., Гейлингер К. Моноклональные антитела против основного гликопротеина (gp350 / 220) вируса Эпштейна-Барра нейтрализуют инфекционность. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1980 сентябрь; 77 (9): 5307–5311. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Литтман Д. Р., Томас Й., Мэддон П. Дж., Чесс Л., Аксель Р. Выделение и последовательность гена, кодирующего Т8: молекулы, определяющие функциональные классы Т-лимфоцитов.Клетка. 1985 Февраль; 40 (2): 237–246. [PubMed]
  • Келлер П.М., Нефф Б.Дж., Эллис Р.В. Три основных гена гликопротеинов вируса ветряной оспы, продукты которых имеют нейтрализующие эпитопы. J Virol. 1984 Октябрь; 52 (1): 293–297. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Burnette WN. «Вестерн-блоттинг»: электрофоретический перенос белков с додецилсульфат-полиакриламидных гелей натрия на немодифицированную нитроцеллюлозу и рентгенографическое обнаружение с помощью антител и радиоактивного йода белка А.Анальная биохимия. 1981 апр; 112 (2): 195–203. [PubMed]
  • Slot JW, Geuze HJ. Новый метод подготовки золотых зондов для многокомпонентной цитохимии. Eur J Cell Biol. Июль 1985 г., 38 (1): 87–93. [PubMed]
  • Эллис Р.В., Келлер П.М., Лоу Р.С., Зивин Р.А. Использование вектора бактериальной экспрессии для картирования гена главного гликопротеина вируса ветряной оспы-опоясывающего лишая, gC. J Virol. 1985, январь, 53 (1): 81–88. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Keller PM, Davison AJ, Lowe RS, Bennett CD, Ellis RW.Идентификация и структура гена, кодирующего gpII, главный гликопротеин вируса ветряной оспы. Вирусология. 15 июля 1986 г .; 152 (1): 181–191. [PubMed]
  • Келлер П.М., Дэвисон А.Дж., Лоу Р.С., Римен М.В., Эллис Р.В. Идентификация и последовательность гена, кодирующего gpIII, главный гликопротеин вируса ветряной оспы. Вирусология. 1987 Апрель; 157 (2): 526–533. [PubMed]
  • Александр С., старейшина Дж. Х. Углеводы резко влияют на иммунную реактивность антисыворотки к вирусным гликопротеиновым антигенам.Наука. 14 декабря 1984 г .; 226 (4680): 1328–1330. [PubMed]
  • Алмейда Дж. Д., Эдвардс, округ Колумбия, Brand CM, Heath TD. Образование виросом из субъединиц гриппа и липосом. Ланцет. 1975, 8 ноября; 2 (7941): 899–901. [PubMed]
  • Манезис EK, Cameron CH, Gregoriadis G. Липосомы, содержащие поверхностный антиген гепатита B, усиливают гуморальный и клеточно-опосредованный иммунитет к антигену. FEBS Lett. 1979, 1 июня; 102 (1): 107–111. [PubMed]
  • Сакаи Ф., Герлиер Д., Доре Дж. Ф.Ассоциация общего антигена клеточной поверхности, ассоциированного с вирусом, с липосомами. Br J Рак. 1980 Февраль; 41 (2): 227–235. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Zinkernagel RM, Doherty PC. Ограничение цитотоксичности, опосредованной Т-клетками in vitro, при лимфоцитарном хориоменингите в сингенной или полуаллогенной системе. Природа. 1974, 19 апреля; 248 (5450): 701–702. [PubMed]
  • KEMPE CH. Изучение оспы и осложнений вакцинации против оспы. Педиатрия. 1960 августа; 26: 176–189.[PubMed]
  • Brown JP, Twardzik DR, Marquardt H, Todaro GJ. Вирус осповакцины кодирует полипептид, гомологичный эпидермальному фактору роста и трансформирующему фактору роста. Природа. 1985 7 февраля; 313 (6002): 491–492. [PubMed]
  • Эппштейн Д.А., Марш Ю.В., Шрайбер А.Б., Ньюман С.Р., Тодаро Г.Дж., Нестор Дж.Дж., мл. Занятие рецептора эпидермального фактора роста подавляет инфицирование вирусом осповакцины. Природа. 19 декабря 1985 г .; 318 (6047): 663–665. [PubMed]
  • Паникали Д., Паолетти Э.Конструирование поксвирусов в качестве клонирующих векторов: вставка гена тимидинкиназы из вируса простого герпеса в ДНК инфекционного вируса осповакцины. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1982, август; 79 (16): 4927–4931. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Mackett M, Smith GL, Moss B. Вирус осповакцины: выбираемый эукариотический вектор для клонирования и экспрессии. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1982 Dec; 79 (23): 7415–7419. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Shih MF, Arsenakis M, Tiollais P, Roizman B.Экспрессия гена S вируса гепатита В векторами вируса простого герпеса типа 1, несущими альфа- и бета-регулируемые химеры генов. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1984 сентябрь; 81 (18): 5867–5870. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Strnad BC, Schuster T., Klein R, Hopkins RF, 3rd, Witmer T., Neubauer RH, Rabin H. Производство и характеристика моноклональных антител против мембраны вируса Эпштейна-Барра антиген. J Virol. Январь 1982, 41 (1): 258–264. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]

Здесь представлены статьи из материалов Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки, любезно предоставленные Национальной академией наук


Околоатомная криогенная крио Электронная микроскопия структуры капсидов вируса ветряной оспы

  • 1.

    Шмид Д. С. и Джумаан А. О. Влияние вакцины против ветряной оспы на динамику вируса ветряной оспы. Clin. Microbiol. Ред. 23 , 202–217 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 2.

    Арвин, А. М. Вирус ветряной оспы. Clin. Microbiol. Ред. 9 , 361–381 (1996).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 3.

    Росс, А. Х. Модификация ветряной оспы в семейных контактах путем введения гамма-глобулина. N. Engl. J. Med. 267 , 369–376 (1962).

    CAS PubMed Google ученый

  • 4.

    Всемирная организация здравоохранения. Вакцины против ветряной оспы и опоясывающего герпеса: позиционный документ ВОЗ, июнь 2014 г. Wkly. Эпидемиол. Рек. 89 , 265–287 (2014).

    Google ученый

  • 5.

    Lukas, K., Edte, A. & Bertrand, I. Влияние опоясывающего герпеса и постгерпетической невралгии на качество жизни: результаты, сообщаемые пациентами в шести европейских странах. Z. Gesundh. Wiss. 20 , 441–451 (2012).

    PubMed Google ученый

  • 6.

    Johnson, R. W. et al. Влияние опоясывающего герпеса и постгерпетической невралгии на качество жизни. BMC Med. 8 , 37 (2010).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 7.

    Гилден, Д. Х., Кляйншмидт-ДеМастерс, Б. К., Ла Гуардия, Дж. Дж., Махалингам, Р. и Корс, Р. Дж. Неврологические осложнения реактивации вируса ветряной оспы. N. Engl. J. Med. 342 , 635–645 (2000).

    CAS PubMed Google ученый

  • 8.

    Пергам, С. А., Лимай, А. П., Сообщество специалистов по инфекционным заболеваниям AST. Вирус ветряной оспы при трансплантации твердых органов: рекомендации Практического сообщества Американского общества трансплантации инфекционных заболеваний. Clin. Пересадка. 33 , e13622 (2019).

    PubMed Google ученый

  • 9.

    Bozzola, E. & Bozzola, M. Осложнения ветряной оспы и всеобщая иммунизация. J. Pediatr. 92 , 328–330 (2016).

    Google ученый

  • 10.

    Gnann, J. W. Jr. Вирус ветряной оспы: атипичные проявления и необычные осложнения. J. Infect. Дис. 186 (Дополнение 1), S91 – S98 (2002).

    PubMed Google ученый

  • 11.

    Quinlivan, M. & Breuer, J. Клинические и молекулярные аспекты живой аттенуированной вакцины против ветряной оспы Ока. Rev. Med. Virol. 24 , 254–273 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • 12.

    Коэн Дж. И. Геном вируса ветряной оспы. Curr. Верхний. Microbiol. Иммунол. 342 , 1–14 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 13.

    Staprans, S. I. et al. Усиленная репликация SIV и ускоренное прогрессирование до СПИДа у макак, примированных для создания ответа Т-лимфоцитов CD4 на белок оболочки SIV. Proc. Natl Acad. Sci. США 101 , 13026–13031 (2004).

    CAS PubMed Google ученый

  • 14.

    Willer, D. O. et al. Экспериментальное заражение макак cynomolgus ( Macaca fascicularis ) вирусом ветряной оспы человека. J. Virol. 86 , 3626–3634 (2012).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 15.

    Perciani, C. T. et al. Протокол рандомизированного контролируемого исследования, характеризующего иммунные ответы, вызванные вакцинацией против вируса ветряной оспы (VZV) у здоровых кенийских женщин: создание условий для потенциальной вакцины против ВИЧ на основе вируса ветряной оспы. BMJ Open 7 , e017391 (2017).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 16.

    Perciani, C. T. et al. Живая аттенуированная вакцина против вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая не индуцирует активацию клеток-мишеней ВИЧ. J. Clin. Инвестировать. 129 , 875–886 (2019).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 17.

    Ландмайер, С.и другие. Генно-инженерные реактивные CD4 + цитотоксические Т-клетки вируса ветряной оспы обладают опухолеспецифической эффекторной функцией. Cancer Res. 67 , 8335–8343 (2007).

    CAS PubMed Google ученый

  • 18.

    Tanaka, M. et al. Вакцинация, направленная на нативные рецепторы, для усиления функции и пролиферации Т-клеток, модифицированных химерными рецепторами антигена (CAR). Clin. Cancer Res. 23 , 3499–3509 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 19.

    Карпентер, Дж. Э., Хатчинсон, Дж. А., Джексон, В. и Гроуз, С. Выход легких частиц среди филоподий на поверхность клеток, инфицированных вирусом ветряной оспы. J. Virol. 82 , 2821–2835 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 20.

    Кук, М.Л. и Стивенс, Дж. Г. Лабильная шерсть: причина появления неинфекционного бесклеточного вируса ветряной оспы в культуре. J. Virol. 2 , 1458–1464 (1968).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 21.

    Харсон Р. и Гроуз К. Выход вируса ветряной оспы из клетки меланомы: тропизм для меланоцитов. J. Virol. 69 , 4994–5010 (1995).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 22.

    Gershon, A.A. et al. Внутриклеточный транспорт вновь синтезированного вируса ветряной оспы: окончательная оболочка в сети транс-Гольджи. J. Virol. 68 , 6372–6390 (1994).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 23.

    Чен, Дж. Дж., Чжу, З., Гершон, А. А. и Гершон, М. Д. Зависимость от маннозо-6-фосфатного рецептора при инфицировании вирусом ветряной оспы in vitro и в эпидермисе во время ветряной оспы и опоясывающего лишая. Cell 119 , 915–926 (2004).

    CAS PubMed Google ученый

  • 24.

    Дай, Х. и Чжоу, З. Х. Структура капсида вируса простого герпеса 1 с ассоциированными белковыми комплексами тегумента. Наука 360 , eaao7298 (2018).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 25.

    Лю, Ю. Т., Джи, Дж., Дай, X., Би, Г. К. и Чжоу, З. Х. Крио-ЭМ-структуры портальной вершины вируса простого герпеса 1 типа и упакованного генома. Nature 570 , 257–261 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 26.

    Yuan, S. et al. Крио-ЭМ структура капсида вируса герпеса при 3,1 Å. Наука 360 , eaao7283 (2018).

    PubMed Google ученый

  • 27.

    Wang, J. et al. Структура C-капсида вируса простого герпеса 2-го типа со специфическим для капсида компонентом. Nat. Commun. 9 , 3668 (2018).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 28.

    Yu, X., Jih, J., Jiang, J. & Zhou, Z.H. Атомная структура капсида цитомегаловируса человека с его защитным слоем тегумента из pp150. Наука 356 , eaam6892 (2017).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 29.

    Zhang, Y. et al. Атомная структура капсида вируса герпеса 6В человека и комплексов тегумента, ассоциированного с капсидом. Nat. Commun. 10 , 5346 (2019).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 30.

    Gong, D. et al. Портал упаковки ДНК и комплексы тегументов, ассоциированных с капсидом в опухолевом герпесвирусе KSHV. Ячейка 178 , 1329–1343 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 31.

    Dai, X. et al. Структура и мутагенез выявляют важные взаимодействия капсидных белков для репликации KSHV. Nature 553 , 521–525 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 32.

    Ilca, S. L. et al. Локализованная реконструкция субъединиц по электронно-криомикроскопическим изображениям макромолекулярных комплексов. Nat. Commun. 6 , 8843 (2015).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 33.

    Zhou, Z.H. et al. Четыре уровня иерархической организации, включая нековалентную кольчугу, защищают капсид зрелого опухолевого герпесвируса от давления. Структура 22 , 1385–1398 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 34.

    Cardone, G. et al. Белок тегумента UL36 вируса простого герпеса 1 имеет составной сайт связывания в вершинах капсида. J. Virol. 86 , 4058–4064 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 35.

    Grunewald, K. et al. Трехмерная структура вируса простого герпеса по данным криоэлектронной томографии. Наука 302 , 1396–1398 (2003).

    PubMed Google ученый

  • 36.

    Wolfstein, A. et al. Внутренняя оболочка способствует подвижности капсида вируса простого герпеса по микротрубочкам in vitro. Трафик 7 , 227–237 (2006).

    CAS PubMed Google ученый

  • 37.

    Radtke, K. et al. Двигатели микротрубочек, направленные на плюс и минус, одновременно связываются с капсидами вируса простого герпеса, используя различные внутренние структуры тегумента. PLoS Pathog. 6 , e1000991 (2010).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 38.

    Чаудхури В., Соммер М., Раджамани Дж., Зербони Л. и Арвин А. М. Функции капсидного белка ORF23 вируса ветряной оспы в репликации вируса и патогенез кожной инфекции. J. Virol. 82 , 10231–10246 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 39.

    Zhou, Z. H. et al. Сборка VP26 в вирусе простого герпеса-1, полученная из структур дикого типа и рекомбинантных капсидов. Nat. Struct. Биол. 2 , 1026–1030 (1995).

    CAS PubMed Google ученый

  • 40.

    Huet, A. et al. Обширные контакты субъединиц лежат в основе стабильности капсида вируса герпеса и аллостерии от внутреннего к внешнему. Nat. Struct. Мол. Биол. 23 , 531–539 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 41.

    Liu, Y. T. et al. Димер pUL25 взаимодействует с капсидом и тегументом вируса псевдобешенства. J. Gen. Virol. 98 , 2837–2849 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 42.

    Бауэр, Д. У., Хаффман, Дж. Б., Хома, Ф. Л. и Эвилевич, А. Геном вируса герпеса, давление продолжается. J. Am. Chem. Soc. 135 , 11216–11221 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 43.

    Brandariz-Nunez, A., Liu, T., Du, T. и Evilevitch, A. Высвобождение вирусного генома под давлением в ядро ​​хозяина является механизмом, приводящим к герпетической инфекции. eLife 8 , e47212 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 44.

    Дай, X., Гонг, Д., Ву, Т. Т., Сан, Р. и Чжоу, З. Х. Организация компонентов тегумента, связанных с капсидом, в герпесвирусе Капоши, связанном с саркомой. J. Virol. 88 , 12694–12702 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 45.

    Snijder, J. et al. Вершинно-специфические белки pUL17 и pUL25 механически усиливают капсиды вируса простого герпеса. J. Virol. 91 , e00123-17 (2017).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 46.

    Чжан, З.и другие. Полногеномный мутагенез показывает, что ORF7 является новым кожно-тропным фактором VZV. PLoS Pathog. 6 , e1000971 (2010).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 47.

    Homa, F. L. et al. Структура капсида вируса псевдобешенства: сравнение с вирусом простого герпеса 1 типа и дифференциальное связывание основных минорных белков. J. Mol. Биол. 425 , 3415–3428 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 48.

    Liu, W. et al. Структуры капсида и капсид-ассоциированного тегументного комплекса внутри вируса Эпштейна – Барра. Nat. Microbiol. https://doi.org/10.1038/s41564-020-0758-1 (2020).

  • 49.

    Desai, P., DeLuca, N. A. & Person, S. VP26 вируса простого герпеса типа 1 не важен для репликации в культуре клеток, но влияет на выработку инфекционного вируса в нервной системе инфицированных мышей. Virology 247 , 115–124 (1998).

    CAS PubMed Google ученый

  • 50.

    Krautwald, M., Maresch, C., Klupp, B.G., Fuchs, W. & Mettenleiter, T.C. Делеция или зеленая флуоресцентная маркировка белка капсидного компонента pUL35 вируса псевдобешенства нарушает репликацию вируса в культуре клеток и нейроинвазию у мышей. J. Gen. Virol. 89 , 1346–1351 (2008).

    CAS PubMed Google ученый

  • 51.

    Borst, E. M., Mathys, S., Wagner, M., Muranyi, W. & Messerle, M.Генетические доказательства важной роли белка малого капсида цитомегаловируса в росте вирусов. J. Virol. 75 , 1450–1458 (2001).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 52.

    Perkins, E. M. et al. Белок малого капсида pORF65 необходим для сборки капсидов герпесвируса Капоши, ассоциированного с саркомой. J. Virol. 82 , 7201–7211 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 53.

    Uetz, P. et al. Сети герпесвирусных белков и их взаимодействие с протеомом человека. Наука 311 , 239–242 (2006).

    CAS PubMed Google ученый

  • 54.

    Stellberger, T. et al. Улучшение дрожжевой двугибридной системы с помощью перестановочных гибридных белков: взаимодействие вируса ветряной оспы. Proteome Sci. 8 , 8 (2010).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 55.

    Wang, W. et al. ORF7 вируса ветряной оспы взаимодействует с ORF53 и играет роль в его локализации в сети транс-Гольджи. Virol. Грех. 32 , 387–395 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 56.

    Liu, J. et al. Серологическая оценка иммунитета к вирусу ветряной оспы на основе нового конкурентного иммуноферментного анализа. Sci. Отчет 6 , 20577 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 57.

    Jiang, H. F. et al. ORF7 вируса ветряной оспы необходим для обволакивания цитоплазмы вируса в дифференцированных нейрональных клетках. J. Virol. 91 , e00127–00117 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 58.

    Selariu, A. et al. ORF7 вируса ветряной оспы является нейротропным фактором. J. Virol. 86 , 8614–8624 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 59.

    Wang, W. et al. Слияние внешней ядерной мембраны соседних ядер в синцитии, индуцированной вирусом ветряной оспы и опоясывающего лишая. Вирусология 512 , 34–38 (2017).

    CAS PubMed Google ученый

  • 60.

    Mastronarde, D. N. SerialEM: программа для автоматического серийного сбора данных по наклону на микроскопах Tecnai с использованием прогнозирования положения образца. Microsc. Микроанал. 9 , 1182–1183 (2003).

    Google ученый

  • 61.

    Zheng, S.Q. et al. MotionCor2: анизотропная коррекция движения, вызванного лучом, для улучшенной криоэлектронной микроскопии. Nat. Методы 14 , 331–332 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 62.

    Zhang, K. Gctf: определение и коррекция CTF в реальном времени. J. Struct. Биол. 193 , 1–12 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 63.

    Грант Т., Роху А. и Григорьев Н. cisTEM, удобное программное обеспечение для обработки изображений отдельных частиц. eLife 7 , e35383 (2018).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 64.

    Ян, Х., Sinkovits, R. S. & Baker, T. S. AUTO3DEM — автоматизированная высокопроизводительная программа для реконструкции изображений икосаэдрических частиц. J. Struct. Биол. 157 , 73–82 (2007).

    CAS PubMed Google ученый

  • 65.

    Киманиус, Д., Форсберг, Б. О., Шерес, С. Х. и Линдаль, Э. Ускоренное определение крио-ЭМ структуры с распараллеливанием с использованием графических процессоров в RELION-2. eLife 5 , e18722 (2016).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 66.

    Шерес, С. Х. и Чен, С. Предотвращение переобучения при определении крио-ЭМ структуры. Nat. Методы 9 , 853–854 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 67.

    Кучукельбир А., Сигворт Ф. Дж. И Тагаре Х. Д. Количественная оценка местного разрешения крио-ЭМ карт плотности. Nat. Методы 11 , 63–65 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • 68.

    Pettersen, E. F. et al. UCSF Chimera — система визуализации для поисковых исследований и анализа. J. Comput. Chem. 25 , 1605–1612 (2004).

    CAS Google ученый

  • 69.

    Эмсли, П. и Коутан, К. Кут: инструменты построения моделей для молекулярной графики. Acta Crystallogr. Д 60 , 2126–2132 (2004).

    PubMed Google ученый

  • 70.

    Adams, P. D. et al. PHENIX: комплексная система на основе Python для решения макромолекулярных структур. Acta Crystallogr. Д 66 , 2010, 213–221.

    CAS PubMed Google ученый

  • 71.

    Chen, V. B. et al. MolProbity: проверка структуры всех атомов для кристаллографии макромолекул. Acta Crystallogr. Д 66 , 2010, 12–21.

    CAS PubMed Google ученый

  • Что такое вакцины на основе вирусных векторов и как их можно использовать против COVID-19?

    Краткий обзор

    Вакцины на основе вирусных векторов отличаются от большинства обычных вакцин тем, что на самом деле они не содержат антигены, а используют собственные клетки организма для их производства.Они делают это с помощью модифицированного вируса (вектора) для доставки генетического кода антигена, в случае шиповых белков COVID-19, обнаруженных на поверхности вируса, в клетки человека. Заражая клетки и инструктируя их производить большое количество антигена, который затем запускает иммунный ответ, вакцина имитирует то, что происходит при естественном заражении определенными патогенами, особенно вирусами. Это имеет то преимущество, что вызывает сильный клеточный иммунный ответ Т-лимфоцитами, а также выработку антител В-клетками.Примером вирусной векторной вакцины является вакцина rVSV-ZEBOV против лихорадки Эбола.

    Преимущества и недостатки вакцин на основе вирусных векторов

    Хорошо зарекомендовавшая себя технология

    Сильный иммунный ответ

    Иммунный ответ включает В-клетки и Т-клетки

    Предыдущее воздействие переносчика может снизить эффективность

    Относительно сложные в производстве

    Как такие вакцины вызывают иммунитет?

    Вирусы выживают и размножаются, вторгаясь в клетки своего хозяина и захватывая их механизмы по производству белков, поэтому он считывает генетический код вируса и создает новые вирусы.Эти вирусные частицы содержат антигены, молекулы, которые могут вызвать иммунный ответ. Похожий принцип лежит в основе вирусных векторных вакцин — только в этом случае клетки-хозяева получают только код для производства антигенов. Вирусный вектор действует как система доставки, предоставляя средства для проникновения в клетку и вставки кода для антигенов другого вируса (патогена, против которого вы пытаетесь вакцинировать). Сам вирус безвреден, и, заставляя клетки производить только антигены, организм может безопасно создавать иммунный ответ, не развивая болезни.

    В качестве переносчиков были разработаны различные вирусы, включая аденовирус (вызывающий простуду), вирус кори и вирус коровьей оспы. Эти векторы лишены каких-либо болезнетворных генов, а иногда и генов, которые могут позволить им реплицироваться, что означает, что они теперь безвредны. Генетические инструкции по получению антигена из патогена-мишени вшиты в геном вирусного вектора.

    Существует два основных типа вакцин на основе вирусных векторов. Нереплицирующиеся векторные вакцины не способны производить новые вирусные частицы; они производят только вакцинный антиген.Реплицирующиеся векторные вакцины также производят новые вирусные частицы в инфицированных ими клетках, которые затем продолжают инфицировать новые клетки, которые также будут производить вакцинный антиген. В разрабатываемых вирусных векторных вакцинах COVID-19 используются нереплицирующиеся вирусные векторы.

    После введения в организм эти вакцинные вирусы начинают инфицировать наши клетки и внедрять свой генетический материал, включая ген антигена, в ядра клеток. Человеческие клетки производят антиген, как если бы это был один из их собственных белков, и он представлен на их поверхности вместе со многими другими белками.Когда иммунные клетки обнаруживают чужеродный антиген, они вызывают иммунный ответ против него.

    Этот ответ включает продуцирующие антитела В-клетки, а также Т-клетки, которые ищут и уничтожают инфицированные клетки. Т-клетки делают это, исследуя репертуар белков, экспрессируемых на поверхности клеток. Они были обучены распознавать собственные белки организма как «собственные», поэтому, если они заметят чужеродный белок, такой как антиген патогена, у них возникнет иммунный ответ против клетки, несущей его.

    Одна из проблем этого подхода заключается в том, что люди, возможно, ранее подвергались воздействию вирусного вектора и вызывали иммунный ответ против него, снижая эффективность вакцины. Такой «противовирусный иммунитет» также затрудняет доставку второй дозы вакцины при условии, что это необходимо, если только эта вторая доза не доставляется с использованием другого вирусного вектора.

    Насколько легко их изготовить?

    Основным препятствием для производства вирусных векторных вакцин является масштабируемость.Традиционно вирусные векторы выращивают в клетках, которые прикреплены к субстрату, а не в свободно плавающих клетках, но это трудно сделать в больших масштабах. В настоящее время разрабатываются линии суспензионных клеток, которые позволят выращивать вирусные векторы в больших биореакторах. Сборка векторной вакцины также представляет собой сложный процесс, включающий несколько этапов и компонентов, каждый из которых увеличивает риск заражения. Поэтому после каждого шага требуется тщательное тестирование, что увеличивает затраты.

    Вирус ветряной оспы кодирует вирусную ловушку RHIM для подавления гибели клеток

    Abstract

    Известно, что герпесвирусы кодируют ряд ингибиторов гибели клеток-хозяев, в том числе белки, содержащие мотив гомотипного взаимодействия RIP (RHIM). Вирус ветряной оспы (VZV) является членом подсемейства альфа-герпесвирусов и вызывает ветряную оспу и опоясывающий лишай. Мы идентифицировали новый вирусный RHIM в капсидном триплексном белке VZV, открытой рамке считывания (ORF) 20, который действует как ингибитор гибели клетки-хозяина.Подобно клеточным RHIM человека в RIPK1 и RIPK3, которые стабилизируют некросому при некроптозе, индуцированном TNF, и вирусному RHIM в M45 из мышиного цитомегаловируса, который ингибирует гибель клеток, ORF20 RHIM способен образовывать фибриллярные функциональные амилоидные комплексы. Примечательно, что ORF20 RHIM образует гибридные амилоидные комплексы с человеческим ZBP1, цитоплазматическим сенсором вирусной нуклеиновой кислоты. Хотя VZV может ингибировать TNF-индуцированный некроптоз, ORF20 RHIM, по-видимому, не отвечает за это ингибирование. Напротив, путь ZBP1 идентифицируется как важный для инфекции VZV.Мутация ORF20 RHIM делает вирус неспособным к эффективному распространению в ZBP1-экспрессирующих клетках HT-29, эффект, который может быть обращен ингибированием каспаз. Таким образом, мы заключаем, что VZV ORF20 RHIM важен для предотвращения апоптоза, управляемого ZBP1, во время инфекции VZV, и предполагаем, что он опосредует этот эффект, секвестрируя ZBP1 в ложные амилоидные сборки.

    Информация об авторе

    мотивов гомотипического взаимодействия RIP (RHIM) обнаружены в белках-хозяевах, которые могут сигнализировать о запрограммированной гибели клеток, и в вирусных белках, которые могут ее предотвратить.Комплексы, стабилизированные межмолекулярными взаимодействиями с участием RHIM, имеют фибриллярную амилоидную структуру. Мы идентифицировали новый RHIM в белке ORF20, экспрессируемом вирусом Varicella zoster (VZV), который образует комплексы на основе амилоида с клеточными RHIM человека. В то время как другие RHIM вируса герпеса подавляют некроптоз, этот новый VZV RHIM нацелен на RHIM-содержащий белок ZBP1 хозяина для ингибирования апоптоза во время инфекции. Это первое исследование, демонстрирующее важность пути ZBP1 в инфекции VZV и определение роли вирусного RHIM в ингибировании апоптоза.Это расширяет наше понимание путей защиты хозяина и демонстрирует, как патогены используют амилоидную стратегию-приманку для обхода реакции хозяина.

    Образец цитирования: Steain M, Baker MODG, Pham CLL, Shanmugam N, Gambin Y, Sierecki E, et al. (2020) Вирус ветряной оспы кодирует вирусную ловушку RHIM для подавления гибели клеток. PLoS Pathog 16 (7): e1008473. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473

    Редактор: Эдвард Мокарски, Центр вакцин Эмори, США

    Получено: 6 марта 2020 г .; Принята к печати: 28 мая 2020 г .; Опубликовано: 10 июля 2020 г.

    Авторские права: © 2020 Steain et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

    Финансирование: Работа выполнена при финансовой поддержке Австралийского исследовательского совета M. Sunde и E.S. (DP180101275), поддержка программы исследовательской подготовки MB, грант BioMed Connect от Сиднейской медицинской школы M.Сунде и А.А., грант в рамках Соединительной схемы Сиднейского университета для М. Стейна и Национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям, финансирующий А. А. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Вирусы разработали широкий спектр стратегий, позволяющих уклоняться от внутренних, врожденных и адаптивных иммунных ответов хозяина.Члены семейства Herpesviridae , вирус простого герпеса (HSV) -1 и цитомегаловирус человека и мыши (HCMV / MCMV) являются мастерами управления путями гибели клеток-хозяев, такими как апоптоз и некроптоз, с целью успешного распространения и установления латентного периода [ 1–3]. Хотя вирус ветряной оспы (VZV) вызывает значительное бремя для здоровья [4–6], механизмы, используемые VZV для подрыва реакции хозяина, полностью не выяснены. Первичная инфекция VZV приводит к ветряной оспе, широко известной как ветряная оспа.Во время этой инфекции вирус устанавливает латентный период в сенсорных нейронах, и когда VZV-специфический Т-клеточный иммунитет ослабевает, вирус может реактивироваться, что приводит к опоясывающему лишая (опоясывающий лишай) [7]. Осложнения, возникающие в результате реактивации VZV, включают длительную боль, называемую постгерпетической невралгией, энцефалитом и васкулопатией VZV (см. Обзор [8]).

    VZV является вирусом с высокой степенью ассоциированности с клетками и не выделяет бесклеточные вирионы в культуру [9], что вызывает необходимость ассоциированного с клетками размножения вируса in vitro .VZV также высоко видоспецифичен, не прогрессируя до продуктивной инфекции в клетках нечеловеческого происхождения [10]. Следовательно, не существует животной модели, которая воспроизводила бы полный спектр болезни VZV. В совокупности эти свойства VZV в значительной степени затрудняют характеристику патогенеза VZV.

    Смерть клеток может быть инициирована при обнаружении вирусного патогена как средство преждевременного прерывания жизненного цикла вируса и тем самым ограничения распространения инфекции. Апоптоз и некроптоз могут быть частью противовирусного ответа [2, 11–14].Наиболее хорошо изученный путь некроптоза вызван фактором некроза опухоли (TNF). При связывании TNF со своим рецептором (TNF-R1) клеточный ингибитор белков апоптоза (cIAP 1 и 2) опосредует K63-убиквитинирование протеинкиназы 1, взаимодействующей с рецептором (RIPK1), как часть сигнальной платформы, известной как комплекс I, которая управляет Передача сигналов NF-κB (обзор в [15]). Если cIAP ингибируются (например, с помощью миметиков SMAC), RIPK1 может связываться с FADD, каспазой 8 и cFLIP (названный комплексом II). Это может приводить к расщеплению каспазы 8 и запускать апоптоз [16, 17].Однако, если каспаза 8 также ингибируется, тогда RIPK1 может взаимодействовать с взаимодействующей с рецептором протеинкиназой 3 (RIPK3), чтобы управлять некроптозом [18, 19].

    RIPK1 и RIPK3 взаимодействуют посредством высококонсервативных мотивов гомотипического взаимодействия RIP (RHIMs), что приводит к сборке комплекса некросом [20]. Некросомный комплекс RIPK1: RIPK3 имеет фибриллярную структуру и стабилизируется амилоидным кросс-β ядром, образованным взаимодействиями между RHIMs двух компонентных белков [21]. Генерация некросомы приводит к фосфорилированию RIPK3, который впоследствии фосфорилирует белок, подобный домену киназы смешанного происхождения (MLKL) [22].Фосфорилированный MLKL управляет проницаемостью мембраны, что приводит к разрыву клетки и некроптотической гибели клеток [23, 24].

    Клеточный Z-ДНК-связывающий белок 1 (ZBP1, также известный как DAI) содержит по крайней мере два RHIM (A и B), а также может взаимодействовать с RIPK3 [25–27]. Первоначально ZBP1 был идентифицирован как цитозольный ДНК-сенсор [28], однако совсем недавно исследования с вирусом гриппа A (IAV) и MCMV показали, что ZBP1 может воспринимать вирусную РНК [29, 30] и одновременно активировать апоптоз и некроптоз в одной и той же популяции. ячеек [29].Это означает, что ингибирование каспазы 8 не всегда необходимо для протекания некроптоза по этому пути.

    Некоторые вирусы, включая HSV-1, HSV-2, HCMV и MCMV, развили механизмы ингибирования каспазы 8 и, следовательно, внешнего апоптоза [31–33], а также некроптоза [2, 34, 35]. Было высказано предположение, что некроптоз возник как резервный механизм, обеспечивающий устранение инфицированных вирусом клеток [2]. Эта теория подтверждается исследованиями, показывающими, что мыши с дефицитом RIPK3, киназы, необходимой для некроптоза, погибают от фатальной инфекции вирусом осповакцины, тогда как мыши дикого типа — нет [36].

    Многие из признанных в настоящее время вирусных белковых ингибиторов некроптоза содержат RHIM [37]. MCMV кодирует RHIM близко к N-концу нефункциональной рибонуклеотидредуктазы, M45. Этот кодируемый вирусами RHIM, как было показано, взаимодействует с RIPK3, подавляя некроптоз [34, 38]. Кроме того, мутация MCMV для устранения способности вируса ингибировать некроптоз делает MCMV сильно аттенуированным in vivo [34]. Мы недавно предложили механизм, с помощью которого M45 нарушает основанную на RHIM передачу сигналов клеточной смерти, формируя гетеромерные ложные амилоидные структуры [39].Мы продемонстрировали, что M45, как и человеческие белки RHIM, способен спонтанно образовывать амилоидные фибриллы. Мы также продемонстрировали, что M45 способен образовывать сети гибридных гетеромерных амилоидных структур с RIPK1 и RIPK3 более благоприятным образом, чем взаимодействие двух человеческих белков друг с другом. Вероятно, что эти белковые комплексы человек: вирус в силу некоторых свойств своей конформации неспособны передавать сигналы нижестоящим эффекторам, и, таким образом, передача сигналов гибели клеток сокращается.

    HSV-1 и -2 также содержат RHIMs в N-концевых областях функциональных белков инфицированных рибонуклеотидредуктазами клеток (ICP) 6 и ICP10 соответственно [40–42]. Было показано, что ICP6 и ICP10 блокируют некроптоз в клетках человеческого происхождения в ответ на TNF и FasL [41, 42]. Кроме того, сообщалось, что ICP6 защищает клетки человека от гибели клеток, вызванной ZBP1 [43].

    VZV, HSV-1 и HSV-2 принадлежат к подсемейству Alphaherpesvirinae и обладают высокой степенью гомологии.Таким образом, мы стремились определить, содержит ли VZV также RHIM, который может ингибировать некроптоз. Мы идентифицировали последовательность RHIM в пределах открытой рамки считывания (ORF) 20 капсидного триплексного белка. Подобно хорошо охарактеризованным RHIM в RIPK1, RIPK3 и M45, этот RHIM способен управлять образованием амилоидных структур, и RHIM ORF20 взаимодействует с RIPK3 и ZBP1 RHIMs in vitro . Поразительно, однако, хотя VZV может ингибировать TNF-индуцированный некроптоз, этот эффект нельзя приписать присутствию RHIM в белке ORF20 VZV.Вместо этого этот недавно идентифицированный вирусный RHIM взаимодействует с ZBP1, и его основная функция, по-видимому, заключается в подавлении апоптоза, управляемого ZBP1, посредством образования гибридных амилоидных структур-ловушек.

    Результаты

    VZV ORF20 содержит RHIM

    Учитывая, что в HSV-1 и HSV-2 большая субъединица рибонуклеотидредуктазы содержит функциональный RHIM [40–42, 44], мы исследовали аминокислотную последовательность ортолога в VZV, которая кодируется ORF19. С-концевые домены рибонуклеотидредуктазы R1 из HSV-1 и VZV (ICP6 и ORF19 соответственно) имеют 44% гомологии на аминокислотном уровне [45], однако мы обнаружили, что VZV ORF19 кодирует более короткий R1, в котором отсутствует RHIM.Затем мы исследовали оставшуюся часть генома VZV, чтобы найти потенциальный RHIM. Мы обнаружили RHIM-подобную последовательность в ORF20, которая кодирует триплексную субъединицу 1 капсида (рис. 1A и 1B). Этот предполагаемый RHIM расположен в N-концевой области ORF20, между L24 и Y40 (рис. 1B). ORF20 гомологичен белку триплексной субъединицы капсида ВПГ-1 VP19C [46]. По сравнению с белками ортологов других герпесвирусов консервативность первых 111 аминокислот VP19C низкая, и мутационный анализ показал, что сборка капсида не нарушается изменениями первых 107 кодонов VP19C [46].Следовательно, возможно, что N-конец ORF20 может служить ингибитором клеточной гибели без нарушения функции капсида. Центральная тетрада остатков в этом потенциальном VZV RHIM представляет собой IQIG, соответствующий консенсусу I / V-Q-I / V / L-G, обнаруженному в клеточных RHIM [20], и ряд других остатков является консервативным. Этот потенциальный RHIM сохранялся в каждом геноме VZV, который мы исследовали, включая вакцинные штаммы Varivax и VarilRix (S1A Fig). Затем мы расширили наш поиск и обнаружили, что по крайней мере основные тетрадные остатки этого потенциального RHIM (I / VQI / VG) были законсервированы у других представителей рода Varicellovirus , для которых была доступна последовательность ортолога ORF20, включая вирус ветряной оспы обезьян (Simian Varicella Virus (Simian Varicella Virus) SVV), вирус псевдобешенства (PRV), вирус герпеса крупного рогатого скота (BHV) 1 и 5 и вирус герпеса лошадей (EHV) 1, 4, 8 и 9 (S1B, фиг.).Такой уровень сохранения убедительно свидетельствует о том, что этот мотив важен для успешного распространения варицелловирусов .

    Рис. 1. VZV ORF20 содержит RHIM, который ингибирует TNF-индуцированный некроптоз в клетках аденокарциномы HT-29.

    (A) Схематическая диаграмма белков, содержащих RHIM. Местоположение RHIM обозначено желтым прямоугольником. (B) Выравнивание аминокислотной последовательности нового RHIM, идентифицированного в ORF20 VZV (штамм Дюма), с другими известными клеточными RHIM человека из RIPK3, RIPK1, TRIF и ZBP1 и вирусными RHIM из MCMV (M45), HSV-1 (ICP-6) ) и HSV-2 (ICP10), что также указывает процент сохранения и консенсусную последовательность, с квадратами ядра RHIM.(C) Цитопатический эффект и иммунофлуоресцентное окрашивание для антигенов VZV (IE62, pORF29 и гликопротеиновый комплекс gE: gI, зеленый) в VZV-инфицированных и ложных HT-29s. После иммуноокрашивания клетки контрастировали с DAPI (синий). Шкала показывает 20 мкм ( D) Жизнеспособность фиктивных и VZV-инфицированных HT-29 (72 ч после инфицирования) после обработки TNF (T; 30 нг / мл), BV-6 (S; 1 мкМ), z -VAD-fmk (V; 25 мкМ) и некростатин-1 (Nec1; 30 мкМ) по отдельности или в комбинации, как указано. Данные были нормализованы для контроля только ДМСО.Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего, из 4 независимых повторов статистическую значимость определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.g001

    Вирус ветряной оспы может инфицировать клетки аденокарциномы HT-29 и блокировать TNF-индуцированный некроптоз

    Многие культивируемые клетки, такие как человеческие фибробласты (HF), которые обычно используются для выращивания и изучения инфекции VZV, лишены экспрессии RIPK3, что делает их устойчивыми к некроптозу [47].Кроме того, VZV обладает высокой видоспецифичностью и может вызвать полную продуктивную инфекцию только в клетках человеческого происхождения [48]. Следовательно, чтобы изучить модуляцию путей некроптоза с помощью VZV, мы должны были идентифицировать клеточную линию, которая была восприимчива как к инфекции VZV, так и к некроптозу. Клеточная линия колоректальной аденокарциномы человека HT-29 широко использовалась для изучения некроптоза [19, 22, 41, 47], однако до настоящего времени не было сообщений о продуктивной инфекции VZV в этой клеточной линии. Чтобы определить, может ли VZV инфицировать HT-29, клетки выращивали до ~ 70% конфлюэнтности, а затем добавляли HF, инфицированные VZV rOKA, в соотношении 1: 8.Клеточно-ассоциированная инфекция использовалась из-за сильно ассоциированной с клетками природы VZV-инфекции in vitro [9], и этот подход обычно используется для инфицирования клеток in vitro [49–52]. В течение 72 часов цитопатический эффект (ЦПЭ) легко наблюдался в VZV-инфицированных HT-29 (рис. 1C), и дальнейшее пассирование вируса клеточно-ассоциированным образом в HT-29 могло быть продолжено. Кроме того, после нескольких пассажей для удаления инфицированного инокулята HF проводили иммунофлуоресцентное окрашивание на VZV: немедленные ранние (IE62), ранние (pORF29) и поздние белки (комплекс gE: gI).Это показало, что полный каскад экспрессии гена VZV произошел в HT-29, и клеточная локализация каждого вирусного антигена была типичной для продуктивной инфекции [53–55] (Рис. 1C). Вместе это показывает, что VZV способен продуктивно инфицировать HT. -29 клеток аденокарциномы.

    Чтобы определить, может ли инфекция VZV вызывать устойчивость к некроптозу, вирусы HT-29, инфицированные вирусом VZV (72 ч после инфицирования, 24–45% gE: gI антиген +), и ложно инфицированные HT-29 обрабатывали комбинациями TNF. (T), миметик Smac BV-6 (S) и z-VAD-fmk (V) для ингибирования каспазы 8.Затем через 17–18 ч после обработки определяли процент выживших клеток путем измерения внутриклеточных уровней АТФ. В среднем из четырех биологических повторов обработка клеток одним TNF снижала выживаемость клеток в VZV-инфицированных клетках по сравнению с ложными до умеренной, но значительной степени, хотя как ложные, так и VZV-инфицированные HT-29 клетки были в равной степени восприимчивы к апоптотической гибели клеток. индуцированный лечением T + S (рис. 1D). Однако после лечения, индуцирующего некроптоз (T + S + V), выживало значительно больше клеток от инфекции VZV по сравнению с имитацией (в среднем 69% vs.39%) (рис. 1D). Добавление некростатина-1 ингибировало гибель клеток, индуцированную T + S + V, в популяциях, инфицированных имитатором, и VZV, подтверждая участие RIPK1 в этом пути гибели клеток. Кроме того, ложные и VZV-инфицированные клетки, обработанные комбинациями T + S + V, собирали для анализа иммуноблоттинга (IB). Эти анализы показали, что фосфорилированный MLKL (pMLKL) признак индукции некроптоза может легко наблюдаться в ложно инфицированных, но не в инфицированных VZV клетках, обработанных T + S + V (S1C фиг.).Инфекция VZV также, по-видимому, не влияла на общие клеточные уровни MLKL. Вместе эти результаты предполагают, что инфекция VZV придает устойчивость к некроптозу, индуцированному TNF.

    Инфекция VZV ингибирует фосфорилирование MLKL

    Клеточно-ассоциированная природа инфекций VZV означает, что в культуре, инфицированной вирусом VZV, присутствует смесь клеток-свидетелей и инфицированных вирусом клеток. Чтобы определить, предотвращает ли VZV-инфекция фосфорилирование MLKL только в инфицированных клетках, проводили двойное иммунофлуоресцентное окрашивание на антиген VZV и pMLKL.Имитирующие и VZV-инфицированные HT-29 обрабатывали только ДМСО (контроль) или T + S + V в течение 7-8 часов, затем фиксировали и иммуноокрашивали на ранний вирусный белок VZV IE62 (зеленый) и pMLKL (красный). Внутри ложно инфицированных культур HT-29, обработанных T + S + V, pMLKL можно было легко увидеть локализованным на клеточных мембранах (рис. 2A), при этом в среднем 21,8% (диапазон: 15,9–28,8%) клеток pMLKL были положительными по сравнению с три биологических повтора (рис. 2В). Внутри VZV-инфицированной культуры HT-29 окрашивание pMLKL наблюдалось преимущественно в VZV-антиген-отрицательных клетках после обработки (рис. 2A), в среднем 10.8% (диапазон 8,6–15%) антиген-отрицательных клеток являются положительными по pMLKL и значительно меньше положительных по VZV-антигену клеток (в среднем 3,4%, диапазон 1,1-6,5%) (рис. 2B). Никакого специфического окрашивания pMLKL не наблюдалось в клетках, обработанных DMSO контролем, в ложных или VZV-инфицированных культурах (фиг. 2A). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что инфекция VZV может придавать устойчивость к TNF-индуцированному некроптозу до фосфорилирования MLKL.

    Рис. 2. Инфекция VZV ингибирует фосфорилирование MLKL во время TNF-индуцированного некроптоза.

    (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание фосфорилированного антигена MLKL (красный) и VZV IE62 (зеленый) в ложных и инфицированных VZV клетках аденокарциномы HT-29, необработанных (контроль DMSO) или обработанных TNF (T; 30 нг / мл), BV- 6 (S; 1 мкМ) и z-VAD-fmk (V; 25 мкМ) в течение 7–8 часов, чтобы вызвать некроптоз. После иммуноокрашивания клетки контрастировали с DAPI (синий). (B) Процент клеток, которые были положительными по pMLKL, определяли путем случайной визуализации 10-20 неперекрывающихся областей каждого слайда и ручного подсчета клеток в 3 независимых экспериментах.Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего, статистическая значимость была определена с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Шкала показывает 20 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.g002

    VZV ORF20 RHIM не ингибирует TNF-индуцированный некроптоз

    Чтобы определить, является ли RHIM-подобная последовательность, идентифицированная в VZV ORF20, ответственна за наблюдаемое ингибирование TNF-индуцированного некроптоза, мы попытались экспрессировать ORF20 изолированно в HT-29.Первоначально мы попытались использовать подход стабильной трансдукции на основе лентивируса и протестировали три различных лентивирусных конструкции с ORF20, управляемым промотором CMV или EF1α. Мы также протестировали систему временной трансдукции с использованием аденовирусов с дефицитом репликации. Однако с помощью обоих подходов мы обнаружили, что не можем достичь высокого процента HT-29, экспрессирующих VZV ORF20, несмотря на то, что каждый вектор управляет устойчивой экспрессией ORF20 в клетках 293T и / или HF. Таким образом, мы продолжили мутировать ORF20 RHIM внутри VZV посредством «рекомбинирования» с использованием бактериальной искусственной хромосомы (BAC) VZV.Замена тетрааланином была произведена в основных аминокислотах ORF20 RHIM (IQIG на AAAA), поскольку эта мутация обычно используется для отключения функций RHIM (рис. 1A). Предыдущие исследования вирусных RHIM в MCMV и HSV-1 показали, что замена тетрааланином в ядре RHIM в значительной степени устраняет способность этих вирусов ингибировать некроптоз [34, 41]. После продуцирования родительского вируса и вируса с мутацией ORF20 RHIM (VZV-RHIMmut) в эпителиальных клетках ARPE-19 вирус переносили на HT-29 и пассировали несколько раз (5+), чтобы гарантировать отсутствие переноса ARPE. осталось.Затем оценивали выживаемость клеток в ложных и инфицированных VZV HT-29 после обработки комбинациями T, S и V, как описано выше. Чтобы гарантировать возможность сравнения результатов между родительским (pOKA, полученным из ВАС) и мутантным вирусом, процент HT-29, экспрессирующих гликопротеиновый комплекс VZV gE: gI, определяли с помощью проточной цитометрии в начале каждого анализа для обоих вирусов (S2 Инжир). Этот анализ продемонстрировал, что процент положительных по антигену VZV клеток в родительских культурах и культурах HT-29, инфицированных VZV-RHIMmut, был очень похожим.Как было показано ранее для VZV rOKA (фиг. 1), штамм VZV pOKA, полученный из ВАС, все еще был способен ингибировать некроптоз по сравнению с имитацией (выживаемость клеток 50,7% против 29,9%). Однако удивительно, что мутировавший вирус с тетрааланиновой заменой RHIM (VZV-RHIMmut) защищал клетки почти в такой же степени (выживаемость клеток 45%) (рис. 3). Для дальнейшего изучения роли RHIM мы сконструировали вирус, у которого были удалены все 20 аминокислот ORF20 RHIM (VZV-RHIMKO). Этот вирус также был способен ингибировать некроптоз по сравнению с имитацией HT-29, однако в несколько меньшей степени, чем то, что наблюдалось для VZV pOKA (S2B фиг.).Этот результат предполагает, что VZV ORF20 RHIM не играет главной роли в ингибировании TNF-индуцированного некроптоза в клетках HT-29 и что задействованы другие вирусные механизмы.

    Рис. 3. VZV ORF20 RHIM не участвует в TNF-индуцированном некроптозе.

    (A) Жизнеспособность фиктивных, VZV и VZV RHIM мутантных (VZV-RHIMmut) вирусов HT-29, инфицированных (72 ч после инфицирования) после обработки TNF (T; 30 нг / мл), BV-6 (S; 1 мкМ), z-VAD-fmk (V; 25 мкМ) и некростатин-1 (Nec1; 30 мкМ) по отдельности или в комбинации, как указано.Данные были нормализованы для контроля только ДМСО. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего для 4 независимых повторов, а статистическая значимость была определена с использованием двухфакторного дисперсионного анализа.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.g003

    VZV ORF20 RHIM ингибирует ZBP1-управляемый апоптоз во время инфекции

    Пути, ведущие к гибели клеток, могут происходить от более чем одного предшествующего инициатора [35, 37]. Учитывая, что VZV RHIM, по-видимому, оказывает ограниченное влияние на модуляцию TNF-направленного некроптоза, мы стремились определить, может ли он влиять на сигнальные пути гибели клеток, происходящие от других триггеров в контексте инфекции.Недавние исследования, посвященные изучению внутренних иммунных ответов на вирусную инфекцию, продемонстрировали, что белок, чувствительный к нуклеиновой кислоте ZBP1, является ключевым инициатором различных путей гибели клеток в ответ на MCMV, HSV-1 и IAV [27, 29, 43, 56]. Чтобы проверить, играет ли ZBP1 роль в инициации запрограммированной гибели клеток во время инфекции VZV, мы провели анализы инфекционных центров с использованием HT-29, которые были сконструированы для экспрессии ZBP1 посредством трансдукции лентивируса, или контрольных HT-29, трансдуцированных пустым вектором. Монослои ZBP1-экспрессирующих или контрольных HT-29 инфицировали в соотношении 1 инфицированных HT-29 (дикого типа) к 10 неинфицированным (ZBP1 / контроль) клеток родительским штаммом, производным от VZV BAC, или мутантным вирусом RHIM (VZV- RHIMmut) и образование бляшек оценивали через 72 часа после заражения.Клетки иммуноокрашивали на VZV IE63, а инфекционные центры визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии.

    Исходный вирус VZV (pOKA) образовывал бляшки как в экспрессирующих ZBP1, так и в контрольных пустых векторных клетках (фиг. 4A), при этом не было заметной разницы в размере бляшек между двумя типами клеток (фиг. 4B). VZV-RHIMmut легко образовывал бляшки в контрольном пустом векторе HT-29, которые в среднем были того же размера, что и бляшки, образованные pOKA (фиг. 4B). Однако, напротив, распространение вируса VZV-RHIMmut было строго ограничено в клетках, экспрессирующих ZBP1 (фиг. 4A), при этом размер бляшек значительно уменьшился (фиг. 4B).Вирус VZV-RHIMKO образовывал в среднем более крупные бляшки в пустом векторном контроле HT-29, однако, подобно мутантному вирусу RHIM, размер бляшек также был значительно уменьшен в клетках, экспрессирующих ZBP1 (фиг. 4). Учитывая, что во время инфекции гриппа A было показано, что ZBP1 управляет как апоптозом, так и некроптозом [29], и поскольку наши предыдущие результаты предполагали, что VZV не может ингибировать каспазу 8, мы проверили, запускались ли один или оба пути во время заражения двумя мутантами. вирусы. Монослои экспрессирующих ZBP1 или контрольных пустых векторов HT-29 инфицировали в соотношении 1:10, а затем инфицировали ингибитором панкаспазы z-VAD-fmk (25 мкМ) или ингибитором MLKL некросульфонамидом (NSA, 1 мкМ). был добавлен к культурам.После 72 часов заражения оказалось, что добавление некросульфонамида мало повлияло на распространение любого из вирусов (рис. 4). Обработка ZBP1-экспрессирующих HT-29s T + S + V подтвердила, что эти клетки сохраняют способность подвергаться некроптозу (S3 фиг.). Напротив, добавление z-VAD-fmk привело к увеличению среднего размера бляшек для всех трех вирусов в клетках, экспрессирующих ZBP1 (рис. 4B), и увеличило средний размер бляшек для двух мутантных вирусов RHIM до аналогичных уровней, как показано на необработанные пустые векторные контрольные клетки.Это предполагает, что ORF20 RHIM действует, чтобы ингибировать ZBP1-индуцированный апоптоз во время инфекции VZV. Это первый случай, когда вирусный белок RHIM был связан с ингибированием ненекроптотического пути гибели клеток.

    Рис. 4. ZBP1 ограничивает распространение VZV-RHIMmut и VZV-RHIMKO в культуре.

    Пустой вектор или ZBP1, экспрессирующие HT-29, инокулировали родительскими клетками HT-29, имитирующими или инфицированными родительскими клетками VZV (pOKA), VZV-RHIMmut или VZV-RHIMKO. z-VAD-fmk (25 мкМ) или некросульфонамид (NSA; 1 мкМ) добавляли во время инокуляции, где указано.(A) Через 72 часа клетки фиксировали и иммуноокрашивали на VZV IE63 (красный) для оценки распространения вируса. Изображения являются репрезентативными, по крайней мере, из двух независимых повторов. Шкала показывает 500 мкм. (B) Площадь 18-20 бляшек на вирус (как указано) рассчитывалась с использованием Zen 3.1 Blue edition (Zeiss), а статистическая значимость рассчитывалась с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Линия указывает среднее значение, а столбцы ошибок представляют стандартную ошибку среднего.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.g004

    RIPK3 необходим для того, чтобы индуцированная ZBP1 гибель клеток продолжалась в ответ на инфекцию VZV

    Предыдущие сообщения, описывающие индукцию апоптоза ZBP1 в ответ на вирусную инфекцию, показали, что в зависимости от клеточных условий гибель клеток может протекать как RIPK3-зависимым, так и RIPK3-независимым образом [29]. Чтобы выяснить конкретные молекулярные пути, необходимые для ZBP1-индуцированного апоптоза в контексте инфекции VZV, мы стремились определить, необходим ли RIPK3 для гибели клеток.С этой целью мы выполнили анализ инфекционных центров с клетками ARPE-19, клеточной линией, которая, как известно, является пермиссивной для инфекции VZV, которая обладает полным набором каспаз, но не экспрессирует RIPK3 [57]. Для этого анализа сравнивали только родительский штамм VZV и VZV-RHIMmut, поскольку мы установили, что основная тетрада IQIG имеет решающее значение для предотвращения гибели клеток, индуцированной ZBP1 (рис. 4). Клетки ARPE-19, экспрессирующие ZBP1, были сконструированы с помощью лентивирусной трансдукции, и пустые клетки ARPE-19, трансдуцированные вектором, использовали в качестве контроля.Монослои ZBP1-экспрессирующих или контрольных клеток ARPE-19 инфицировали в соотношении 1 инфицированных ARPE-19 (дикого типа) к 10 неинфицированным (ZBP1 / контрольным) клеткам исходным штаммом VZV BAC или мутантным вирусом RHIM ( VZV-RHIMmut), а образование бляшек оценивали через 72 часа после заражения. Затем клетки иммуноокрашивали на VZV IE63, и инфекционные центры визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 5). Исходный вирус VZV образовывал бляшки как в клетках ZBP1, так и в контрольных пустых векторных клетках ARPE-19 одинакового размера и количества.Однако, в отличие от клеток HT-29, экспрессирующих ZBP1, VZV-RHIMmut также способен образовывать бляшки в равной степени как в контрольных, так и в экспрессирующих ZBP1 клетках ARPE-19 (фиг. 5). Добавление z-VAD-fmk не изменяло фенотип ни для родительского VZV, ни для VZV-RHIMmut (фиг. 5). Эти данные показывают, что присутствие ZBP1 и каспазы 8 недостаточно для активации гибели клеток, а RIPK3, скорее всего, необходим для гибели клеток в ответ на инфекцию VZV.

    Рис. 5. ZBP1 не ограничивает распространение VZV или VZV-RHIMmut в RIPK3-дефицитных, способных к апоптозу клетках.

    Пустой вектор или ZBP1, экспрессирующие ARPE-19, инокулировали родительскими клетками ARPE-19, инфицированными родительским VZV (pOKA) или VZV-RHIMmut. z-VAD-fmk (25 мкМ) добавляли во время инокуляции, где указано. Через 72 часа клетки фиксировали и иммуноокрашивали на VZV IE63 (красный) для оценки распространения вируса. Изображения являются репрезентативными, по крайней мере, из двух независимых повторов. Масштабные линейки соответствуют 400 мкм.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.g005

    VZV ORF20 взаимодействует с RIPK3 и ZBP1 в клетках, образуя нерастворимые комплексы с ZBP1

    Подавление вирусом герпеса передачи сигналов белка RHIM хозяина требует прямого взаимодействия белков хозяина и вируса.Для вирусных ингибиторов некроптоза M45 и ICP6 оба белка взаимодействуют напрямую с ZBP1 и RIPK3 через свои соответствующие RHIM, взаимодействие, которое устраняется мутацией основной тетрады вирусного белка до AAAA [27, 38, 41]. Недавно мы продемонстрировали, что для M45 взаимодействие с RIPK3 или ZBP1 приводит к генерации нерастворимой амилоидной структуры, содержащей как вирусные белки, так и белки-хозяева, которые действуют, секвестрируя белок-хозяин и предотвращая нисходящие функции [39]. Мы стремились определить, может ли ORF20 взаимодействовать с RIPK3 и ZBP1 таким же образом.Клетки 293T котрансфицировали плазмидными конструкциями, экспрессирующими либо ORF20, либо ORF20-RHIMmut и GFP, либо ZBP1-GFP, или RIPK3-GFP, и исследовали взаимодействия между клеточными и вирусными RHIM-содержащими белками как в растворимой, так и в нерастворимой фракциях. путем иммунопреципитации (IP). Как ORF20, так и ORF20-RHIMmut, как было обнаружено, взаимодействуют с ZBP1 в растворимой (фиг. 6A) и нерастворимой фракциях (фиг. 6B), что указывает на образование растворимых комплексов, а также нерастворимых супрамолекулярных ансамблей.Способность ORF20-RHIMmut взаимодействовать с ZBP1 была неожиданной, но предполагает, что некоторые остатки внутри RHIM, но за пределами основной тетрады, могут поддерживать взаимодействие между белками. Взаимодействие между ORF20 и RIPK3 и ORF20-RHIMmut и RIPK3 было обнаружено только в растворимой фракции, полученной из клеточных лизатов (фиг. 6C), несмотря на многочисленные анализы нерастворимой фракции. Мы попытались изучить взаимодействия между ORF20 и RIPK1 этим методом и не смогли обнаружить коиммунопреципитацию, несмотря на многочисленные попытки.Мы попытались обнаружить взаимодействия между ORF20 и ZBP1 и RIPK3 во время продуктивного инфицирования клеток VZV, но не смогли продемонстрировать это последовательно из-за ограничений реагентов, доступных для выполнения этих анализов.

    Рис. 6. ORF20 взаимодействует с белками RHIM человека, связанными с передачей сигналов клеточной смерти.

    Клетки 293T трансфицировали конструкциями ORF20 и только ZBP1-GFP или GFP. Клетки собирали и проводили иммунопреципитацию (IP) растворимых и нерастворимых фракций с использованием GFP в качестве приманки.Вестерн-блоттинг (IB) проводили на лизатах иммунопреципитированных и введенных клеток. (A) Иммунопреципитация ZBP1-GFP в растворимой фракции клеточных лизатов. (B) Иммунопреципитация ZBP1-GFP в нерастворимой фракции клеточных лизатов. (C) Иммунопреципитация RIPK3-GFP в растворимой фракции клеточных лизатов. Каждый блот представляет не менее 2 независимых биологических повторов. Стрелки указывают маркеры размера белка.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.g006

    ORF20 RHIM поддерживает образование амилоидных фибрилл

    Было показано, что RHIM в белках хозяина и вирусах ответственны за сборку функциональных амилоидных фибрилл этими белками [21, 39, 58]. Обнаружив, что ORF20 и ZBP1 взаимодействуют друг с другом с образованием больших нерастворимых гетеромерных комплексов, мы стремились определить, обладают ли эти сборки отличительной субструктурой, богатой β-листами, характерной для амилоидных фибрилл [59]. 114 N-концевых остатков ORF20, содержащих RHIM, экспрессировали рекомбинантно в слитом белке с His-меченным убиквитином (Ub-ORF20 1-114 ).Эта конструкция спонтанно собиралась в фибриллы, которые демонстрировали длинную, прямую и неразветвленную морфологию, характерную для амилоидных фибрилл (фиг. 7A). Конструкция слияния, содержащая флуорофор mCherry (mCherry-ORF20 1-114 ) вместо убиквитина, также имела типичную амилоидную морфологию (фиг. 7B). При инкубации с низкомолекулярными амилоидными сенсорами Тиофлавин Т (ThT) и Конго красный присутствие фибрилл Ub-ORF20 1-114 приводило к увеличению эмиссии флуоресценции при 485 нм с ThT и увеличению поглощения при 540 нм с Конго красный, подтверждающий наличие перекрестной β-амилоидной структуры (рис. 7C и 7D).Белковые сборки со слитым белком, содержащим мутацию AAAA в ORF20 RHIM (Ub-ORF20 1-114 mut), показали повышенную эмиссию ThT при 485 нм и поглощение конго красного при 540 нм (рис. 7C и 7D), что указывает на то, что некоторые перекрестные -β субструктура присутствует, однако скорость увеличения флуоресценции ThT была намного ниже, чем у конструкции WT RHIM. Эта конструкция также самоорганизовывалась в большие аморфные агрегаты, лишенные четкой фибриллярной структуры (рис. 7E). Аналогичным образом, мутантный белок AAAA ORF20, меченный mCherry (mCherry-ORF20 1-114 mut), образовывал аморфные структуры, лишенные четкой фибриллярной морфологии (фиг. 7F).Таким образом, ORF20 RHIM способен образовывать амилоидные сборки с характерной морфологией и структурой, а мутация AAAA в основной тетраде нарушает формирование регулярной протяженной фибриллярной структуры.

    Рис. 7. ORF20 RHIM образует гомомерные амилоидные структуры.

    (A) Изображение, полученное с помощью просвечивающей электронной микроскопии структур, образованных Ub-ORF20 1-114 . Масштабная шкала представляет 200 нм. (B) Изображение, полученное с помощью просвечивающей электронной микроскопии, структур, образованных mCherry-ORF20 1-114 .Масштабная шкала представляет 200 нм. (C) Флуоресценция ThT с течением времени конструкций Ub-ORF20 после разведения 8 М мочевины в буфере для сборки. Образец буфера содержит эквимолярный ThT, но не содержит белка. Кривые получены из трех независимых повторов. Планки погрешностей указывают на стандартное отклонение. (D) Спектры поглощения растворов, содержащих конго красный и Ub-ORF20 1-114 и Ub-ORF20 1-114 mut после диализа против буфера для сборки. Буфер относится к образцу конго красного в сборочном буфере без белка.(E) Изображение с помощью просвечивающей электронной микроскопии структур, образованных Ub-ORF20 1-114 mut. Масштабная шкала представляет 200 нм. (F) Изображение с помощью просвечивающей электронной микроскопии структур, образованных mCherry-ORF20 1-114 mut. Масштабная шкала представляет 200 нм.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.g007

    Ядровая тетрада ORF20 RHIM контролирует размер и морфологию комплексов, образованных с RIPK3 и ZBP1

    После наблюдаемых взаимодействий между ORF20 и человеческими RIPK3 и ZBP1 в клетках, мы дополнительно исследовали природу комплексов, образующихся между этими белками in vitro .Конфокальная спектроскопия флуоресценции одиночных молекул использовалась для подтверждения взаимодействий на уровне одиночных молекул. В этом методе используются лазеры, сфокусированные на очень маленьком конфокальном объеме (250x250x800 нм), для обнаружения флуоресцентных сигналов от двух разных белков, меченных двумя разными флуорофорами [60] (рис. 8A). Совпадение флуоресцентных сигналов в смесях белков при низкой концентрации указывает на образование гибридных комплексов, содержащих оба белковых партнера. Были приготовлены флуоресцентно меченые слитые белки с YPet или mCherry, слитыми с белками-хозяевами или вирусными белками соответственно.Мы наблюдали большие сигналы в следах интенсивности флуоресценции для белков ORF20 1-114 , ORF20 1-114 mut, RIPK3 387-518 и ZBP1 170-355 белков при анализе отдельно, что указывает на образование ими гомоолигомеров. белки (рис. 8B, 8C, 8D и 8G). Когда белки ORF20 были смешаны с белками человека в условиях компетентной сборки, как ORF20 1-114 , так и ORF20 1-114 mut, наблюдали образование гетероолигомеров с RIPK3 387-518 и ZBP1 170-355 , на что указывает совпадение флуоресцентных сигналов в обоих каналах (фиг. 8E, 8F, 8H и 8I).Мы также выполнили эксперименты конфокальной спектроскопии для анализа взаимодействий между ORF20 и RIPK1 (S4A фиг.). В соответствии с нашей неспособностью обнаружить взаимодействие между ORF20 и RIPK1 посредством коиммунопреципитации, отсутствие взаимодействия между ORF20- 1-114 -mCherry и минимальной областью RIPK1, которая, как было показано, требуется для взаимодействия с RIPK3 (YPet- RIPK1 497-583 ) [21]. Аналогичным образом, не было обнаружено взаимодействия между YPet-RIPK1 497-583 и ORF20 1-114 mut-mCherry (S4A фиг.).Эти данные указывают на то, что ORF20 и RIPK1 вряд ли будут взаимодействовать напрямую.

    Рис. 8. VZV ORF20 RHIM образует гетеромерные комплексы с RHIM из RIPK3 и ZBP1.

    (A) Схематическое изображение обнаружения флуоресценции из разбавленных растворов, содержащих два разных флуорофора в конфокальном объеме нанолитра. Образцы возбуждаются одновременно двумя перекрывающимися лазерами, и излучение флуорофоров YPet и mCherry регистрируется отдельно. Совпадающие всплески в двух каналах указывают на образование гетеромерных комплексов, содержащих два разных белка (B-I).Репрезентативные флуоресцентные временные диаграммы, собранные из ORF20 1-114 -mCherry, ORF20 1-114 mut-mCherry, YPet-RIPK3 387-518 или YPet-ZBP1 170-355 слитых белков, по отдельности или в смеси попарно в условиях, допускающих совместную сборку. Белки, присутствующие в каждой смеси, указаны для каждой части рисунка. На вставках показаны детали записи двойной флуоресценции в течение 1 с, отмеченные звездочкой на графике полного времени.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.g008

    Учитывая, что мы ранее установили, что взаимодействия между ZBP1 и ORF20 были наиболее релевантными в биологических условиях, мы проанализировали размеры гетерокомплексов, образованных между этими конструкциями. Гистограммы подсчета фотонов отражают распределение размеров частиц, обнаруженных в конфокальном объеме. Анализируя сигнал для mCherry из следов одиночной молекулы, мы определили распределение размеров олигомеров ORF20 1-114 дикого типа и ORF20 1-114 mut по отдельности и в комбинации с ZBP1 170-355 .Для ORF20 RHIM дикого типа не было различия в размере частиц, образованных ORF20 1-114 с ZBP1 170-355 или без него (S5A на фиг.). Это указывает на то, что ORF20 RHIM способен образовывать большие молекулярные сборки сам по себе и во взаимодействии с ZBP1. ORF20 1-114 mut-mCherry образовывал меньшие структуры, чем его аналог дикого типа (S5B фиг.). Кроме того, вместе ORF20 1-114 mut-mCherry и ZBP1 170-355 образуют структуры, меньшие, чем только мутантный ORF20, и существенно меньшие, чем комбинация ORF20 дикого типа и ZBP1, что отражено в гистограммах и в анализе корреляции флуоресценции. следов одиночной молекулы (S5C фиг.).

    Мы также оценили взаимодействия между ORF20 и мутантными формами YPet-ZBP1, где либо первый RHIM ZBP1 был мутирован в AAAA (YPet-ZBP1 170-355 mutA), либо второй RHIM был мутирован в AAAA (YPet-ZBP1 170-355 mutB) (S4B Рис). Мутация первого RHIM ZBP1 снижает способность белка к самосборке в гомомерные амилоидные структуры, и наблюдалась небольшая совместная сборка ORF20 с YPet-ZBP1 170-355 mutA. Мутация второго RHIM не влияет на самосборку, и YPet-ZBP1 170-355 mutB сильно взаимодействует с ORF20 (S4B на фиг.).Эти находки согласуются с сообщениями о влиянии мутаций RHIM на активность ZBP1 в клетках, где первый RHIM в первую очередь связан с взаимодействием и сборкой основанных на RHIM структур [27, 41, 43].

    Смеси ORF20 и ZBP1 образуют гетеромерные амилоидные сборки с фибриллярной морфологией

    Мы недавно предположили, что M45 успешно ингибирует взаимодействия RHIM: RHIM хозяина путем захвата белков хозяина в альтернативные стабильные гибридные амилоидные структуры [39]. Чтобы определить, происходит ли подобный механизм во время взаимодействий ORF20-ZBP1, мы исследовали смеси Ub-ORF20 1-114 и Ub-ORF20 1-114 mut с YPet-ZBP1 170-355 с помощью электронной микроскопии. (Рис. 9A).YPet-ZBP1 170-355 сам по себе образует короткие сгруппированные фибриллы длиной <200 нм, подтверждая ранее описанную амилоидогенную природу ZBP1 [21]. В комбинации с ORF20 дикого типа, однако, были очевидны большие и плотные сети фибрилл (рис. 9A), подобные тем, которые образуются между M45 и RIPK3 [39]. Когда ZBP1 инкубировали с ORF20 1-114 mut, наблюдались только редкие аморфные агрегаты (фиг. 9A). Фибриллы, образованные белками ORF20 и ZBP1 дикого типа, дополнительно исследовали с помощью конфокальной микроскопии с использованием флуоресцентных конструкций ORF20 1-114 -mCherry и YPet-ZBP1 170-355 (фиг. 9B).Это продемонстрировало, что белки были совместно включены в фибриллы. Амилоидная природа этих гетеромерных фибрилл была подтверждена наблюдением сигнала ThT по длине этих фибрилл (фиг. 9B). В целом, эти результаты подтверждают, что ORF20 RHIM способен рекрутировать человеческий ZBP1 RHIM в фибриллярные сборки, и что сети ветвления зависят от основных тетрад RHIM.

    Рис. 9. VZV ORF20 RHIM образует гетеромерные амилоидные фибриллы с ZBP1, которые зависят от центральной тетрады для стабильной сборки более высокого порядка.

    (A) Просвечивающая электронная микрофотография белковых ансамблей, образованных комбинациями слитых белков Ub-ORF20 1-114 , Ub-ORF20 1-114 mut и YPet-ZBP1 170-355 . Масштабная шкала представляет 200 нм. (B) Изображения в конфокальном микроскопе гетерофибрилл, образованных из смеси ORF20 1-114 -mCherry и YPet-ZBP1 170-355 в ThT-содержащем буфере для сборки. Масштабная линейка соответствует 20 мкм. (C) Ядро тетрады IQIG от ORF20 требуется для улавливания ZBP1 в нерастворимых, устойчивых к детергенту агрегатов.SDS-AGE анализ мономерных или собранных форм Ub-ORF20 1-114 , Ub-ORF20 1-114 mut и YPetZBP1 170-355 или их комбинаций. Перед электрофорезом мономерные белки поддерживали в 8 М мочевине. Собранные образцы инкубировали либо с водой, либо с 2% SDS при комнатной температуре в течение 10 минут перед электрофорезом. Идентичность и обработка белка указаны над каждым образцом.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.g009

    Центральная тетрада ORF20 RHIM важна для стабильности фибриллярных сборок ORF20-ZBP1

    Различия в размере и стабильности ансамблей, образованных между ORF20 и ZBP1, исследовали с помощью электрофореза в агарозном геле с додецилсульфатом натрия (SDS AGE).Сборки готовили из каждого белка по отдельности или в комбинации, а затем инкубировали с 2% SDS или без него перед электрофорезом вместе с мономерными формами белков (фиг. 9C). Было обнаружено, что YPet-ZBP1 RHIM образует олигомеры с замедленной подвижностью по сравнению с мономером (фиг. 9C), соответствующие фибриллам длиной <200 нм, наблюдаемым с помощью ПЭМ (фиг. 9A). Совместная сборка с нефлуоресцентным Ub-ORF20 1-114 приводит к удержанию YPet-ZBP1 170-355 в лунках, что указывает на то, что ZBP1 изолируется VZV RHIM в большие сборки, которые слишком велики для введите гель (Фиг.9C).В отличие от фибрилл, образованных одним ZBP1, которые деполимеризуются при инкубации с 2% SDS, эти очень большие гетеромерные амилоидные сборки стабильны и устойчивы к деполимеризации, о чем свидетельствует неизменная подвижность содержащих ZBP1-ORF20 фибрилл после обработки детергентом (рис. 9C).

    Совместная сборка мутов ORF20 1-114 с ZBP1 не приводила к образованию стабильных олигомеров (фиг. 9C). Хотя при взаимодействии ZBP1 и Ub-ORF20 1-114 mut образуются олигомерные структуры (рис. 9A), соответствующие аморфным агрегатам, наблюдаемым с помощью электронной микроскопии, они не такие большие, как те, которые содержат ZBP1 и Ub-ORF20 114 -WT (рис. 9C).Кроме того, эти сборки не устойчивы к обработке 2% SDS (рис. 9C). Эти результаты демонстрируют, что гетеромерные комплексы, образованные между ZBP1 и ORF20-RHIMmut, менее стабильны, чем комплексы, образованные между ZBP1 и ORF20 WT, подтверждая важную роль последовательности IQIG в функциональных взаимодействиях между RHIMs ZBP1 и ORF20.

    Обсуждение

    Это исследование идентифицирует новый вирусный RHIM, кодируемый VZV ORF20. В то время как вирусные RHIM, ранее идентифицированные в других герпесвирусах (MCMV, HSV-1 и -2), как было показано, важны для подавления некроптоза [27, 41], RHIM VZV ORF20 уникален тем, что, по-видимому, его основная роль заключается в ингибирование апоптоза, вызванного ZBP1.Кроме того, мы показываем амилоидную природу VZV ORF20 RHIM и, учитывая амилоидогенную природу ZBP1 RHIM, продемонстрированную здесь и в других местах [21], предполагаем, что ORF20 функционирует как приманка RHIM, изолируя ZBP1 в альтернативных амилоидных ансамблях и снижая его способность взаимодействовать с РИПК3. Мы предполагаем, что RHIM в VZV ORF20 обеспечивает новый механизм для предотвращения ZBP1-индуцированного внешнего апоптоза во время инфекции VZV (фиг. 10). Наши результаты показывают, что ZBP1 чувствует инфекцию VZV внутри клетки.Во время продуктивной инфекции белки ORF20, поступающие из инфекционных капсидов и / или вновь экспрессируемые, взаимодействуют с ZBP1 и через RHIM-зависимые механизмы образуют стабильные гетеромерные амилоидные сборки, которые подавляют обычные сигнальные возможности белка-хозяина. Эти результаты продвигают наше понимание вирусной модуляции передачи сигналов RHIM и демонстрируют разнообразие в отношении ингибирующих ролей вирусных RHIM.

    Рис. 10. Предлагаемый механизм для VZV ORF20 RHIM во время инфекции VZV.

    При заражении клетки-хозяина вирусом VZV вирусная ДНК транспортируется в ядро, а часть потенциально может просочиться в цитоплазму. Затем вирусная ДНК транскрибируется в РНК и экспортируется из ядра. ZBP1 может воспринимать либо РНК VZV, либо ДНК, а затем через RHIM: взаимодействия RHIM активируют RIPK3, чтобы управлять апоптозом. Однако ORF20 RHIM, либо из поступающих вирусных капсидов, либо после синтеза de novo , может взаимодействовать с ZBP1, чтобы предотвратить его запуск апоптоза и, таким образом, продлить выживаемость инфицированной клетки, чтобы обеспечить полный цикл репликации вируса.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.g010

    Вирусный RHIM, идентифицированный в VZV ORF20, по-видимому, является консервативным мотивом в пределах рода Varicellovirus , с другими членами, кодирующими как минимум ядро ​​I / Последовательность VQI / VG в пределах N-конца субъединицы 1 триплекса капсида. Обладают ли эти другие вирусы способностью модулировать передачу сигналов RHIM в своих естественных хозяевах через этот мотив, еще предстоит выяснить. VZV является исключительно человеческим патогеном, поэтому было бы также интересно оценить, обладает ли ORF20 RHIM ингибирующими функциями в нечеловеческих типах клеток или может ли он управлять сборкой некросом аналогично HSV-1 ICP6 и HSV-2 ICP10. в клетках мыши [40, 42].Эти противоположные функции RHIM HSV приводят к предположению, что некроптоз может действовать как видовой барьер для инфекции [41], и известно, что инфекция VZV ингибируется после входа в репликацию в большинстве клеток нечеловеческого происхождения [61] . Кроме того, гибель клеток также важна в опосредовании видоспецифической природы ЦМВ-инфекции [62], однако мы не смогли найти никаких доказательств наличия RHIM-подобного мотива в белке капсидного триплекса 1 любого человеческого бета- или гамма-вируса герпеса.

    ICP6 и ICP10 также связывают и ингибируют каспазу 8 как средство блокирования внешнего апоптоза, управляемого сигналом рецептора смерти, который затем открывает так называемую некроптотическую «ловушку» [35].Таким образом, ICP6 и ICP10 могут одновременно ингибировать апоптоз и некроптоз, управляемый TNF. Мы показали, что вирусы HT-29, инфицированные вирусом VZV, были защищены от некроптоза, вызванного TNF, о чем свидетельствует увеличение выживаемости клеток и отсутствие pMLKL в инфицированных клетках после лечения. Это ингибирование некроптоза нельзя полностью приписать ORF20 RHIM, подразумевая, что VZV кодирует альтернативные механизмы ингибирования TNF-индуцированного некроптоза. HCMV использует механизм, не основанный на RHIM, для ингибирования TNF-индуцированного некроптоза [47], и VZV может использовать аналогичный механизм.Любопытно, однако, что инфекция VZV, по-видимому, не защищает от апоптоза, управляемого TNF. Возникает вопрос, почему VZV кодирует ингибитор некроптоза. Было показано, что инфицирование мышиных макрофагов MCMV, лишенным как M36, так и M45, и, следовательно, неспособным ингибировать передачу сигналов каспазы 8 и RHIM, приводит к высоко воспалительной программе гибели клеток, включающей апоптоз с последующим вторичным некроптозом [63]. Это демонстрирует, что ингибирование каспазы 8 не всегда является предпосылкой для возникновения некроптоза, и поэтому возможно, что в некоторых типах клеток инфекция VZV непосредственно запускает некроптоз, который вирус впоследствии эволюционировал, чтобы ингибировать.Ранее мы показали, что VZV ORF61 может ингибировать TNF-управляемую активацию NF-κB через свой домен убиквитинлигазы E3 [64]. Таким образом, VZV может успешно ингибировать два из трех возможных исходов передачи сигналов TNF. В дополнение к потребности в интактном RHIM, консервативный мотив в C-концевой области M45 и ICP6, который связывается с RIPK1, как было показано, необходим для ингибирования TNF-индуцированного некроптоза [65]. Наше открытие, что в отличие от HSV и MCMV, RHIM в VZV не связан с доменом рибонуклеотидредуктазы, может объяснить разницу в функции VZV RHIM по сравнению с M45 и ICP6.В настоящее время неизвестно, вовлечены ли C-концевые области M45 и ICP6 в путь некроптоза ZBP1.

    Наши данные показывают, что основанный на RHIM механизм, который VZV использует для ингибирования апоптоза, специфически нацелен на ZBP1. Хотя мы обнаружили, что ORF20 и RIPK3 способны взаимодействовать в ряде контекстов (рис. 6, рис. 8), наши исследования взаимодействия клеточных белков показали, что ORF20 способен связывать ZBP1 в большие нерастворимые суперкомплексы (рис. 6), тогда как ORF20 и RIPK3 наблюдались только в растворимых контекстах в клетках, что указывает либо на димерные, либо на небольшие олигомерные структуры взаимодействия, образованные двумя белками.Причина этого различия может быть связана с низкой концентрацией белка в экспериментах с RIPK3, поскольку наблюдали, что трансфекция конструкцией RIPK3-GFP влияет на жизнеспособность клеток, и белок можно было обнаружить только на низких уровнях. С другой стороны, это может указывать на то, что ORF20 образует только большие нерастворимые комплексы с ZBP1. Это может объяснить, почему ORF20 неспособен ингибировать RIPK3-направленные пути некроптоза, вместо этого специфически нацеливаясь на ZBP1 в качестве инициатора.

    Исследования показали, что ZBP1 может одновременно управлять апоптозом и некроптозом после определения IAV [29].Кроме того, ZBP1 может также управлять пироптозом в макрофагах мышей, инфицированных IAV [56]. Мы обнаружили, что в HT-29, экспрессирующих ZBP1, репликация VZV была ограничена, когда ORF20 RHIM был мутирован или удален. Представленные здесь биофизические анализы показывают, что мутация приводит к образованию комплексов уменьшенного размера и стабильности. Мы предполагаем, что эти комплексы, содержащие мутант RHIM, неспособны эффективно и стабильно изолировать и ингибировать весь ZBP1, экспрессируемый в нашей системе во время инфекции VZV-RHIMmut.Добавление ингибитора панкаспазы z-VAD-fmk спасало образование вирусных бляшек обоими мутантными вирусами, тогда как добавление некросульфонамида не имело никакого эффекта, подразумевая, что ZBP1 инициировал апоптоз после заражения VZV и что ORF20 RHIM ингибирует его во время дикой природы. типа инфекции, предположительно путем непосредственного взаимодействия с ZBP1 (рис. 10). Учитывая, что еноны, такие как некросульфонамид, обладают высокой реакционной способностью, период полувыведения некросульфонамида в культуре, вероятно, будет ограничен, и поэтому мы не можем исключить, что также имел место некроптоз.Интересно, что добавление z-VAD-fmk скорее спасало репликацию вируса, чем запускало некроптоз, и это дополнительно подразумевает, что VZV может кодировать другой специфический ингибитор некроптоза.

    Подобно RHIM-содержащим белкам-хозяевам RIPK1, RIPK3 и ZBP1, ORF20 способен к самосборке в гомоолигомерные белковые фибриллы с амилоидной структурой и образует гетероолигомерные фибриллы на основе амилоида. Совместная сборка ORF20 и ZBP1 приводила к образованию очень длинных гетерофибрилл, разительно отличающихся от фибрилл, образованных одним только одним белком, и содержащих оба белка по длине фибриллы.Конфокальная микроскопия и эксперименты с SDS AGE продемонстрировали, что тетрааланин RHIM-мутант ORF20 сохраняет способность взаимодействовать с RIPK3 и ZBP1 RHIMs in vitro . Точно так же путем коиммунопреципитации мы обнаружили, что ORF20 дикого типа и мутантный RHIM может взаимодействовать с ZBP1. Это контрастирует с другими идентифицированными вирусными RHIM, которые теряют способность взаимодействовать с клеточными RHIM, когда основная тетрада мутируется в AAAA [38, 41]. Однако ранее мы продемонстрировали, что некоторая способность образовывать амилоидные сборки также сохраняется, когда основная тетрада RIPK3 мутируется в AAAA [39].Следовательно, мы заключаем, что в ORF20-RHIMmut, как и в RIPK3-RHIMmut, остатки за пределами основной тетрады IQIG могут образовывать межбелковые контакты с другими RHIM, чтобы образовывать комплексы с элементами перекрестной β-структуры. Однако мы также наблюдаем, что в этих мутантных структурах ORF20-RHIMmut-ZBP1 отсутствует четкая структура амилоидных фибрилл ORF20WT-ZBP1, они меньше и менее стабильны, чем комплексы ORF20WT-ZBP1, и это может объяснить, почему вирус VZV-RHIMmut оказался неспособен для ингибирования ZBP1-индуцированной гибели клеток в HT-29.Структура атомного разрешения хозяина RIPK1-RIPK3 RHIM фибриллы амилоидной некросомы демонстрирует, что высокоспецифичные и селективные взаимодействия остаток-остаток определяют стехиометрию и морфологию структур продуктивных некросом хозяина [58]. Таким образом, мы предполагаем, что комплекс дикого типа, образованный ORF20 и ZBP1, имеет особую стабильную фибриллярную архитектуру, которая секвестрирует ZBP1 таким образом, который предотвращает передачу сигнала последним, в то время как взаимодействию между мутантом ORF20 и ZBP1 недостает стабильности и порядка, необходимых для ингибирования. Функция ZBP1.Дальнейшие исследования потребуются для определения полной степени взаимодействующих остатков в этом мотиве, которые могут различаться для разных пар белков, содержащих RHIM. Идентификация новых последовательностей RHIM, таких как последовательность ORF20, поможет в определении минимальных требований к последовательности для функциональных активирующих и / или ингибирующих RHIM и определит роль основной тетрады в сборке функциональной амилоидной некросомы.

    Исследования на мышах показали, что ZBP1 экспрессируется в кератиноцитах и ​​может управлять некроптозом в отсутствие экспрессии RIPK1 [66, 67].Поскольку кератиноциты являются основной мишенью для VZV при ветряной оспе и опоясывающем герпесе [68–70], важно определить, важен ли ORF20 RHIM для репликации вируса в этих клетках кожи. Ранее мы сообщали, что VZV ORF63 может ингибировать апоптоз в нейронах [71, 72]. Еще не определено, экспрессируется ли ZBP1 в сенсорных нейронах, но было бы также интересно оценить, играет ли ингибирование ZBP1 с помощью VZV ORF20 роль в нейрональной инфекции и установлении латентного периода.

    ORF20 является частью триплексного комплекса капсида в дополнение к ORF41 [73]. В настоящее время мы не знаем, требуется ли синтез de novo ORF20 для взаимодействия ORF20 с ZBP1, или может ли капсид-ассоциированный белок на поступающих вирусных частицах выполнять эту роль (Рис. 10). Сборка капсида герпесвируса происходит в ядре инфицированных клеток, однако временная трансфекция ORF20 в клетках приводит в основном к цитоплазматическому распределению белка, и считается, что связывание с другими белками капсида необходимо для облегчения проникновения в ядро ​​[73].Следовательно, ORF20 может взаимодействовать с ZBP1 в цитоплазме инфицированных клеток. Альтернативно, недавнее сообщение предполагает, что активация RIPK3 с помощью ZBP1 может происходить в ядре [74] и, следовательно, ORF20 может вмешиваться в этот процесс во время сборки капсида. Также неясно, воспринимает ли ZBP1 РНК VZV, ДНК или их комбинацию, хотя недавние сообщения показывают, что ZBP1, скорее всего, является сенсором РНК [29, 30].

    Вместе наши результаты показывают, что VZV кодирует новый вирусный RHIM с основной функцией ингибирования апоптоза, индуцированного ZBP1.Наши результаты предполагают, что ORF20 VZV образует амилоидную сборку с ZBP1 посредством взаимодействий RHIM: RHIM для ингибирования гибели клеток во время инфекции VZV. Это также первое сообщение о VZV-ингибировании TNF-индуцированного некроптоза. Эти результаты расширяют наше понимание вирусных манипуляций с путями передачи сигналов RHIM хозяина, которые выходят за рамки только некроптотических сигналов.

    Материалы и методы

    Клетки и вирус

    Клетки аденокарциномы HT-29 (любезный подарок от А / Проф.Susan McLennan), фибробласты крайней плоти человека (HFF-1), ARPE-19 и клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293T (ATCC) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Lonza), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Serana) и пенциллина. / стрептомицин (ThermoFisher Scientific). VZV rOKA был любезным подарком профессора Энн Арвин (Стэнфордский университет, Калифорния, США) и размножался ассоциированным с клетками способом в ARPE, а затем в HT-29. Когда монослои инфицированных клеток проявляли цитопатический эффект в 50–75% клеток, клетки обрабатывали трипсином (трипсин-ЭДТА, Gibco) и добавляли к неинфицированным монослоям клеток в соотношении 1: 6–1: 10, как описано ранее. [49].

    Реактивы и антитела

    Для иммунофлуоресценции использовали следующие антитела: VZV IE62 и gE: гликопротеиновый комплекс gI (клон SG1, Meridian Lifescience), VZV pORF29 и IE63 (любезно предоставленные профессором Полом Кинчингтоном, Университет Питтсбурга, Пенсильвания, США) и фосфорилированный MLKL (Abcam ) или мышиный IgG1, нормальная кроличья сыворотка или RabMab IgG в качестве контроля изотипа. Связанные первичные антитела выявляли с помощью конъюгированных с Alexa Fluor 488 или 594 ослиных антимышиных или вторичных антител против кролика (Life Technologies).

    Антитела, используемые для иммуноблоттинга: кроличьи антифосфорилированные и общие MLKL (Abcam), мышиные анти-VZV ORF20 (антитела Capri), кроличьи антиактиновые антитела, мышиные анти-V5 и кроличьи анти-ZBP1 (Sigma-Aldrich), со вторичной HRP. конъюгированные ослиные антимышиные или ослиные антикроличьи антитела (Санта-Крус).

    Проточная цитометрия для количественного определения клеток, инфицированных VZV

    Mock и VZV-инфицированные клетки HT-29 трипсинизировали и промывали 2 раза в буфере FACS (PBS, содержащий 1% фетальной телячьей сыворотки и 10 мМ EDTA).Затем клетки окрашивали на гликопротеиновый комплекс VZV gE: gI (клон SG1, Meridian Lifescience [конъюгированный в доме с dylight 488]) или на изотипический контроль в течение 20 минут при 4 o C. Затем клетки промывали 2 раза в FACS. буфер и затем инкубировали в буфере для фиксации Cytofix (BD Biosciences). Клетки снова промывали в буфере FACS перед проведением проточной цитометрии с использованием проточного цитометра BD Fortessa, а анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star).

    Плазмидные конструкции

    ORF20 или ORF20-RHIMmut были амплифицированы с помощью ПЦР (Phusion, NEB), метка V5 включена и вставлена ​​в вектор pCDH-EF1, и проверена с помощью расщепления рестрикционными ферментами и секвенирования (Институт Гарвана, Сидней, Австралия).ZBP1, меченный GFP, экспрессировался в pEGFP-N1, предоставленном профессором Элизабет Хартланд (Институт медицинских исследований Хадсона, Австралия), а pEGFP-C1 (Clontech) использовался только в качестве контроля GFP.

    Анализ жизнеспособности клеток

    Неинфицированных и VZV-инфицированных HT-29 высевали в 96-луночные планшеты (10 4 клеток / лунку) и оставляли для прилипания в течение 7 часов перед обработкой комбинациями TNF (R и D), BV-6 (Selleckchem), z-VAD-fmk (AdooQ Bioscience и R и D) и некростатин-1 (Selleck Chemicals) или только ДМСО (Sigma-Aldrich) в качестве контроля в течение 17–18 часов.Жизнеспособность клеток оценивали путем измерения уровней внутриклеточного АТФ с использованием теста CellTitre-Glo2 (Promega). Данные выражали в виде процента выживаемости клеток относительно контроля только с ДМСО. Люминесценцию измеряли с помощью планшет-ридера Infinite M1000 Pro (TECAN). Для каждого эксперимента было выполнено минимум 3 независимых повтора.

    Иммунофлуоресцентное окрашивание

    Для оценки фосфорилирования экспрессии антигенов MLKL и VZV неинфицированные и инфицированные VZV HT-29 высевали на покровные стекла и оставляли на ночь.Затем клетки обрабатывали T + S + V или ДМСО в качестве контроля в течение 7-8 часов. Затем клетки промывали PBS и фиксировали цитофиксом (BD). Клетки пропускали через ледяной метанол в течение 10 минут, затем промывали трис-буферным солевым раствором (TBS). Блокирование выполняли с использованием 20% нормальной ослиной сыворотки (NDS, Sigma-Aldrich), затем первичных антител (разведенных в 10% NDS), инкубированных в течение ночи при 4 o ° C.

    Для обнаружения только антигенов VZV клетки фиксировали Cytofix (BD biosciences), промывали PBS и пропитывали 0.1% Triton X-100 в течение 10 минут (Sigma-Aldrich). Блокирование выполняли с использованием 20% нормальной ослиной сыворотки (NDS, Sigma-Aldrich), затем первичных антител против VZV (разведенных в 10% NDS), инкубированных в течение 1 часа при комнатной температуре. В обоих случаях связанные первичные антитела выявляли с использованием видоспецифичных вторичных антител Alexa Fluor 488 или 594. Затем клетки помещали в антифад Prolong Gold, содержащий 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI) (Life Technologies). Визуализацию выполняли с помощью вертикального микроскопа Zeiss Axioplan 2 с камерой Axiocam (Carl Zeiss).Подсчет pMLKL выполняли путем случайной визуализации 10-20 неперекрывающихся областей каждого слайда и подсчета клеток вручную.

    Анализы инфекционного центра

    ZBP1-экспрессирующих или пустых трансдуцированных вектором клеток HT-29 или ARPE-19 высевали на покровные стекла и оставляли на ночь. Затем каждый тип клеток инфицировали либо VZV-, либо VZV-RHIMmut путем добавления инфицированных клеток HT-29 / ARPE-19 посредством ассоциированной с клеткой инфекции. z-VAD-fmk (R и D) или некросульфонамид (Selleck Chemicals) добавляли в определенные лунки, чтобы исследовать спасение клеток от гибели.Инфицированные клетки инкубировали 72 часа. Затем клетки промывали PBS, фиксировали и иммуноокрашивали на VZV IE63, как описано выше. Для количественного определения размера бляшек рассчитывали площадь 18-20 бляшек на вирус с использованием Zen 3.1 Blue edition (Zeiss).

    Получение мутантных штаммов VZV

    Мутации в геноме VZV были выполнены с использованием бактериальной искусственной хромосомы (BAC), содержащей геном VZV pOKA [75]. Гомологичную рекомбинацию проводили с использованием SW102 E . coli (любезно предоставлено доктором Расселом Дифенбахом), как описано ранее [76]. После вставки кассеты отбора в ген ORF20 ее затем заменяли олигонуклеотидом, содержащим желаемую замену тетрааланином в ядре ORF20 RHIM (от IQIG до AAAA), или олигонуклеотидом с 20 аминокислотами, содержащим удаленный RHIM ORF20 (аминокислота кислоты 21–40 включительно). После рекомбинации геномы ВАС подвергали перевариванию рестрикционными ферментами, и участки, охватывающие мутации, секвенировали (Институт Гарвана, Сидней, Австралия) для подтверждения успешного включения мутации.ВАС очищали с использованием Nucleobond Xtra BAC (Machnery-Nagel), затем трансфицировали в клетки ARPE-19 с использованием Fugene HD (Promega) для выделения инфекционного вируса, который затем размножали, как описано выше.

    Иммунопреципитации

    клеток 293T трансфицировали с использованием Fugene HD (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки собирали в буфере для лизиса DISC (1% Triton X-100, 10% глицерин, 150 мМ NaCl, 2 мМ EDTA и 30 мМ Tris, pH 7,5), содержащем смесь ингибиторов протеазы в соотношении 1: 100 (Sigma Aldrich).Лизаты клеток центрифугировали при 16000 x g при 4 ° C, и супернатант сохраняли как «растворимую» фракцию. Осадок клеток ресуспендировали в денатурирующем буфере (8 М мочевина, 20 мМ Трис, pH 8,0) и инкубировали при 4 ° C в течение ночи при осторожном перемешивании. Эта ресуспензия мочевины была сохранена как «нерастворимая» фракция. GFP-TrapA (Chromotek) использовали для иммунопреципитации GFP-меченых белков из этих фракций по мере необходимости в соответствии с инструкциями производителя. Связанные и входящие фракции разделяли вестерн-блоттингом.

    Вестерн-блоттинг

    Для анализа pMLKL клетки собирали и кипятили в буфере для образцов Лэммли (BioRad), содержащем 1% 2-меркаптоэтанол (Sigma Aldrich). Лизаты белков подвергали электрофорезу с использованием 10% гелей Mini-PROTEAN TGX (BIO-RAD) и переносили на мембраны PDVF (Millipore) с использованием турбо-системы Trans-blot (BIO-RAD). После переноса мембраны промывали PBS, затем блокировали PBS, содержащим 3% бычий сывороточный альбумин (Sigma Aldrich). Первичные антитела применяли в течение ночи, а связанные первичные антитела детектировали путем зондирования вторичными антителами конъюгата с видоспецифическим HRP в 5% обезжиренном молоке.Затем детектирование проводили с помощью хемилюминесценции (GE healthcare life Sciences) и системы Chemidoc XRS + (BIO-RAD).

    Генерация ZBP1-экспрессирующих HT-29s

    ZBP1 клонировали из конструкции ZBP1-GFP и вставляли в лентивектор pCDH-MCS-EF1-neo. Правильность вставки была подтверждена секвенированием (Институт Гарвана, Сидней, Австралия). Лентивирус для ZBP1 или контроль пустого вектора получали в клетках 293Т путем котрансфекции лентивекторов с psPAX2 и pMD2G. Затем HT-29 трансдуцировали частицами лентивируса, и через 3 дня добавляли G418 на следующие 10 дней для отбора успешно трансдуцированных клеток.Экспрессию ZBP1 подтверждали вестерн-блоттингом, как описано выше.

    Экспрессия слитых белков RHIM

    Дикого типа или версии AAAA RHIM-содержащих областей человеческого RIPK3 (Q9Y572; остатки 387–518), человеческого ZBP1 (Q9h271; остатки 170–355) и VZV (штамм Dumas) ORF20 (P09276; остатки 1–114) были экспрессируются как меченные His N- или C-концевые белки YPet, mCherry или слитые белки убиквитина (S6 фиг.) в E . coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen), выращенные в среде LB, содержащей ампициллин.Экспрессию белка индуцировали 0,5 мМ изопропил-β-D-тиогалактозидом (IPTG), когда OD600 культуры достигала 0,6–0,8 в течение 3 часов при 37 o C. Все гибридные белки очищали из телец включения в денатурирующих условиях с использованием Ni. -НТА агарозные шарики (Life Technologies) [39]. Очищенные белки концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon Ultra-15 MWCO 30 000 и хранили в 8 М мочевине, 20 мМ Трис, pH 8,0. Концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белков бицинхониновой кислоты Pierce (Thermo Fisher Scientific).

    Анализы тиофлавина Т для сборки амилоида

    Флуоресцентный краситель-репортер амилоида Тиофлавин Т использовали для отслеживания кинетики образования амилоида. Сборку амилоида инициировали разбавлением белков до конечной концентрации белка 2,5 мкМ и концентрации мочевины 300 мМ 25 мМ NaH 2 PO 4 , 150 мМ NaCl, 40 мкМ ThT, 0,5 мМ DTT, pH 7,4. Анализы проводили в трех экземплярах, при 37 ° C в 96-луночных флуоресцентных планшетах Costar black (Corning) на микропланшетном ридере POLARstar Omega (BMG Labtech) с возбуждением флуоресценции при 440 нм и испусканием при 480 нм.

    Конфокальная спектроскопия одиночных молекул

    Белки, по отдельности или в смеси одного белка, меченного mCherry, и одного белка, меченного YPet, разводили из 8 М мочевинного буфера до конечной концентрации 0,35–0,7 мкМ в 25 мМ NaH 2 PO 4 , 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ДТТ, pH 7,4. Образцы анализировали при комнатной температуре на микроскопе Zeiss Axio Observer, в котором два лазера (488 нм и 561 нм) были сфокусированы в растворе с использованием иммерсионного объектива с числовой апертурой 40 × / 1,2.Сигнал флуоресценции собирали и разделяли с использованием дихроичного зеркала 565 нм, полосового фильтра 525/20 нм для обнаружения белков, меченных YPet, и длиннопроходного фильтра 580 нм для обнаружения белков, меченных mCherry. Для экспериментов с двумя флуорофорами сигналы от двух каналов регистрировались одновременно с интервалом времени 1 мс. Гистограммы подсчета фотонов были получены путем объединения сигналов 10 фотонов. Корреляционный анализ флуоресценции проводили, как у Брауна и Гамбина [77].

    Конфокальная микроскопия

    Белки, по отдельности или в смесях, подвергали диализу при 5 мкМ из 8 М мочевинного буфера в 25 мМ NaH 2 PO 4 , 150 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT, pH 7,4. Образцы (5 мкл) переносили на предметные стекла, покрывали покровным стеклом и отображали на метаспектральном конфокальном микроскопе Zeiss LSM 510 с фильтрами DAPI, GFP и Texas Red для визуализации флуоресценции ThT, YPet и mCherry соответственно. Изображения были проанализированы с помощью ImageJ.

    Просвечивающая электронная микроскопия

    Капля раствора белка (концентрация 5 мкМ, 20 мкл) была помещена на Parafilm, и медная сетка, покрытая углеродом / формваром (200 меш, ProSciTech), плавала на поверхности в течение 1 минуты с последующим удалением избытка раствора капилляром фильтровальная бумага.Сетку трижды промывали фильтрованной водой, затем окрашивали 2% уранилацетатом и отображали с помощью микроскопа Philips CM120, работающего при 120 кВ. Цифровые изображения были записаны с использованием камеры EMSIS Veleta CCD и цифровой системы визуализации iTEM.

    Конго красное окрашивание

    Убиквитин-RHIM белки (как WT, так и AAAA) разводили до 0,3 мг / мл в 8 М мочевинном буфере, а затем диализовали против сборочного буфера (25 мМ NaH 2 PO 4 , 150 мМ NaCl, 0 .5 мМ DTT, pH 7,4) в течение ночи при комнатной температуре. Конго красный добавляли к пробам белка объемом 1 мл до концентрации 2 мкМ в кюветах. Измеряли спектр поглощения каждого раствора белка. Спектры поглощения для образцов, содержащих белок, сравнивали с образцами, содержащими только конго красный. Эффекты рассеяния белков корректировали путем вычитания оптической плотности из спектров образцов белка без конго красного.

    Анализ электрофореза в агарозном геле с додецилсульфатом натрия

    Образцы отдельных белков или их комбинаций разводили до 5 мкМ на белок в 8 М буфере, содержащем мочевину.Часть этих образцов была оставлена ​​для использования в качестве мономерного контроля. Оставшийся образец подвергали диализу против буфера для сборки (25 мМ NaH 2 PO 4 , 150 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT, pH 7,4) в течение ночи, чтобы обеспечить полное формирование белковых сборок. К образцам добавляли глицерин до конечной концентрации 4% и бромфеноловый синий добавляли до конечной концентрации 0,0008%. Образцы инкубировали либо с SDS до конечной концентрации 2%, либо с водой MilliQ в течение 10 минут, а затем анализировали, как в [39].Гели визуализировали на Chemi-Doc (BioRad) с использованием эмиссионных фильтров 605/50 и 695/55 нм.

    Дополнительная информация

    S1 Рис. Возможные RHIMS в штаммах VZV.

    (A) Выравнивание аминокислотных последовательностей различных штаммов VZV, показывающее область ORF20 RHIM и указывающее процент консервативности и консенсусной последовательности. Номера доступа используемых последовательностей VZV: X04370.1, JF306641.2, JQ972913.1, DQ457052.1, KX262866.1, KU926322.1, DQ008355.1, DQ008354.1 Ядро RHIM заключено в рамку (B) Выравнивание аминокислотных последовательностей RHIM, идентифицированного в VZV ORF20 (Dumas) с потенциальными RHIM в триплексной субъединице 1 капсида из других варицелловирусов , вируса ветряной оспы обезьян (SVV), Cercopithecine herpesvirus 9 (CeHV-9), бычьего герпеса (BHV) -1 и — 5, бубалиновый вирус герпеса 1 (BuHV-1), вирус герпеса лошадей (EHV) -, -4, -8 и -9, вирус псевдобешенства (PRV), вирус герпеса кошек -1 (FHV1) и вирус герпеса собак -1 (CaHV-1) .(C) Иммуноблот-анализ ложных и VZV-инфицированных HT-29 с последующим введением TNF (T; 30 нг / мл), BV-6 (S; 1 мкМ), z-VAD-fmk (V; 25 мкМ). * представляет собой неспецифическую полосу, стрелки указывают маркеры размера белка.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.s001

    (TIF)

    S2 Рис. Заражение родительским и мутантным RHIM VZV.

    (A) Средний процент VZV-инфицированных клеток в культурах родительского и мутантного вируса VZV RHIM HT-29 в начале каждого анализа жизнеспособности, как определено окрашиванием проточной цитометрии для гликопротеинового комплекса gE: gI.Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего для 4 независимых повторов. (B) Жизнеспособность фиктивного вируса с удаленным вирусом VZV и VZV RHIM (VZV-RHIMKO), инфицированных HT-29 (72 ч после инфицирования) после обработки TNF (T; 30 нг / мл), BV-6 (S; 1 мкМ) ), z-VAD-fmk (V; 25 мкМ) и некростатин-1 (Nec1; 30 мкМ) по отдельности или в комбинации, как указано. Данные были нормализованы для контроля только ДМСО. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего для 3 независимых повторов, а статистическая значимость была определена с использованием двухфакторного дисперсионного анализа.C. Средний процент VZV-инфицированных клеток в культурах HT-29 родительского вируса и VZV RHIM удаленного вируса в начале каждого анализа жизнеспособности, как определено окрашиванием проточной цитометрии для гликопротеинового комплекса gE: gI. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку среднего для 3 независимых повторов.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.s002

    (TIF)

    S3 Рис. ZBP1-экспрессирующие HT-29 с T + S + V сохраняют способность подвергаться некроптозу.

    ZBP1, экспрессирующие HT-29, обрабатывали ДМСО (без обработки, NT) или TNF (T; 30 нг / мл), BV-6 (S; 1 мкМ), z-VAD-fmk (V; 25 мкМ) в течение 18 ч, затем измеряли жизнеспособность клеток с помощью анализа Promega Cell Titre Glo2.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.s003

    (TIF)

    S4 Рис. Дополнительная информация о потенциале ORF20 для взаимодействия с другими RHIM-содержащими белками.

    Типичные временные профили конфокальной флуоресцентной спектроскопии, собранные из (A) ORF20 1-114 -mCherry и ORF20 1-114 mut-mCherry с YPet-RIPK1 497-583 и (B) YPet-ZBP1 170 -355 mutA или YPet-ZBP1 170-355 слитые белки mutB с ORF20 1-114 -mCherry.Белки инкубировали по отдельности или смешивали попарно в условиях, допускающих совместную сборку. Белки, присутствующие в каждой смеси, указаны для каждой части рисунка. Вставки показывают детализацию 1 с записи двойной флуоресценции во время, указанное звездочкой на полной временной шкале.

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.s004

    (TIF)

    S5 Рис. Влияние мутации RHIM на размер олигомеров, образованных между ORF20 и ZBP1.

    (A) Гистограмма подсчета фотонов интенсивности флуоресценции, обнаруженная в канале излучения mCherry, отражает распределение частиц олигомера по размеру в течение 3-минутного периода для ORF20 1-114 -mCherry отдельно или в комбинации с YPet-ZBP1 170-355. (B) Гистограмма подсчета фотонов интенсивности флуоресценции, обнаруженной в канале излучения mCherry, отражает распределение частиц олигомера по размеру в течение 3-минутного периода для ORF20 1-114 mut-mCherry отдельно или в комбинации с YPet-ZBP1 170-355. (C) Корреляционный анализ флуоресценции показывает распределение частиц разного размера, отраженное коэффициентом корреляции (тау).

    https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008473.s005

    (TIF)

    Благодарности

    Авторы выражают признательность за возможности и научную и техническую помощь Сиднейскому центру исследований в области микроскопии и микроанализа и центру молекулярной биологии Института Бош при Сиднейском университете.Авторы выражают благодарность A / Prof. Сьюзан МакЛеннан (Сиднейский университет, Новый Южный Уэльс, Австралия) за поставку клеточной линии HT-29, Луизе Коул и Центру передовой микроскопии Института Бош в Сиднейском университете за помощь и поддержку в области флуоресцентной микроскопии, профессору Полу Кинчингтону (Университет Питтсбурга) , PA, США) за поставку VZV BAC и антител, Элизабет Хартланд (Институт медицинских исследований Хадсона, Вик, Австралия) за конструкцию экспрессии GFP-ZBP1 и доктора Джеймса Мерфи (Институт Уолтера и Элизабет Холл, Вик, Австралия), профессора Эдварду Мокарски (Университет Эмори) и Айлис О’Кэрролл (Университет Нового Южного Уэльса, Сидней, Австралия) за полезные советы.

    Ссылки

    1. 1. Mocarski ES, Guo H, Kaiser WJ. Некроптоз: троянский конь в клеточно-автономной противовирусной защите хозяина. Вирусология. 2015; 479–480: 160–6. pmid: 25819165; PubMed Central PMCID: PMC5115625.
    2. 2. Мокарски Е.С., Аптон Дж. В., Кайзер В. Дж. Вирусная инфекция и эволюция регулируемых каспазой 8 путей апоптоза и некротической смерти. Nat Rev Immunol. 2012. 12 (2): 79–88. Epub 2011/12/24. pmid: 22193709.
    3. 3. Ю Икс, Хэ С.Взаимодействие между инфекцией вируса простого герпеса человека и путями гибели клеток при апоптозе и некроптозе. Вирол Дж. 2016; 13:77. Epub 2016/05/08. pmid: 27154074; PubMed Central PMCID: PMC4859980.
    4. 4. Бернал Дж. Л., Хоббелен П., Амиртхалингам Г. Бремя осложнений ветряной оспы в системе вторичной медицинской помощи, Англия, 2004–2017 гг. Euro Surveill. 2019; 24 (42): 1

      3. pmid: 31640840.
    5. 5. Goh AEN, Choi EH, Chokephaibulkit K, Choudhury J, Kuter B, Lee PI и др.Бремя ветряной оспы в Азиатско-Тихоокеанском регионе: систематический обзор литературы. Экспертиза вакцин. 2019; 18 (5): 475–93. Epub 2019/03/15. pmid: 30869552.
    6. 6. Gilden D, Nagel M, Cohrs R, Mahalingam R, Baird N. Вирус ветряной оспы в нервной системе. F1000Res. 2015; 4. Epub 2016/02/27. pmid: 26

      1; PubMed Central PMCID: PMC4754002.
    7. 7. Арвин А.М., Моффат Дж. Ф., Редман Р. Вирус ветряной оспы: аспекты патогенеза и реакции хозяина на естественную инфекцию и вакцину против ветряной оспы.Adv Virus Res. 1996; 46: 263–309. pmid: 8824702.
    8. 8. Нагель М.А., Гилден Д. Неврологические осложнения реактивации вируса ветряной оспы. Curr Opin Neurol. 2014. 27 (3): 356–60. pmid: 24792344; PubMed Central PMCID: PMC4189810.
    9. 9. Веллер TH. Серийное размножение in vitro агентов, продуцирующих тельца включения, полученных от ветряной оспы и опоясывающего герпеса. Proc Soc Exp Biol Med. 1953. 83 (2): 340–6. Epub 1953/06/01. pmid: 13064265.
    10. 10. Зербони Л., Сен Н., Оливер С.Л., Арвин А.М.Молекулярные механизмы патогенеза вируса ветряной оспы. Nat Rev Microbiol. 2014; 12 (3): 197–210. pmid: 24509782; PubMed Central PMCID: PMC4066823.
    11. 11. Холлер Н., Зару Р., Мишо О., Том М., Аттингер А., Валитутти С. и др. Fas запускает альтернативный, независимый от каспазы-8 путь гибели клеток с использованием киназы RIP в качестве эффекторной молекулы. Nat Immunol. 2000. 1 (6): 489–95. pmid: 11101870.
    12. 12. Кавахара А., Осава Ю., Мацумура Н., Учияма Ю., Нагата С. Каспазно-независимое уничтожение клеток Fas-ассоциированным белком с доменом смерти.J Cell Biol. 1998. 143 (5): 1353–60. pmid: 9832562; PubMed Central PMCID: PMC2133085.
    13. 13. Орзалли MH, Kagan JC. Апоптоз и некроптоз как стратегии защиты хозяина для предотвращения вирусной инфекции. Trends Cell Biol. 2017; 27 (11): 800–9. Epub 24.06.2017. pmid: 28642032; PubMed Central PMCID: PMC5653411.
    14. 14. Vercammen D, Beyaert R, Denecker G, Goossens V, Van Loo G, Declercq W. и др. Ингибирование каспаз увеличивает чувствительность клеток L929 к некрозу, опосредованному фактором некроза опухоли.J Exp Med. 1998. 187 (9): 1477–85. pmid: 9565639; PubMed Central PMCID: PMC2212268.
    15. 15. Донделингер Ю., Дардинг М., Бертран М. Дж., Вальчак Х. Полиубиквитинирование при некроптозе, опосредованном TNFR1. Cell Mol Life Sci. 2016; 73 (11–12): 2165–76. pmid: 27066894; PubMed Central PMCID: PMC4887548.
    16. 16. Ли Л., Томас Р. М., Сузуки Х, Де Брабандер Дж. К., Ван Х, Харран П. Г.. Небольшая молекула, имитирующая Smac, усиливает опосредованную TRAIL и TNF-альфа гибель клеток. Наука. 2004. 305 (5689): 1471–14.pmid: 15353805.
    17. 17. Ван Л., Ду Ф, Ван X. TNF-альфа индуцирует два различных пути активации каспазы-8. Клетка. 2008. 133 (4): 693–703. pmid: 18485876.
    18. 18. Zhang DW, Shao J, Lin J, Zhang N, Lu BJ, Lin SC и др. RIP3, регулятор энергетического метаболизма, который переключает вызванную TNF гибель клеток с апоптоза на некроз. Наука. 2009. 325 (5938): 332–6. pmid: 19498109.
    19. 19. Хе С., Ван Л., Мяо Л., Ван Т., Ду Ф, Чжао Л. и др. Взаимодействующая с рецептором протеинкиназа-3 определяет некротический ответ клеток на TNF-альфа.Клетка. 2009. 137 (6): 1100–11. Epub 2009/06/16. pmid: 19524512.
    20. 20. Sun X, Yin J, Старовасник MA, Fairbrother WJ, Dixit VM. Идентификация нового мотива гомотипического взаимодействия, необходимого для фосфорилирования рецептор-взаимодействующего белка (RIP) с помощью RIP3. J Biol Chem. 2002. 277 (11): 9505–11. pmid: 11734559.
    21. 21. Ли Дж., Маккуэйд Т., Симер А.Б., Напечниг Дж., Мориваки К., Сяо Ю.С. и др. Некросома RIP1 / RIP3 образует функциональный сигнальный комплекс амилоида, необходимый для запрограммированного некроза.Клетка. 2012; 150 (2): 339–50. pmid: 22817896; PubMed Central PMCID: PMC3664196.
    22. 22. Sun L, Wang H, Wang Z, He S, Chen S, Liao D и др. Белок, подобный домену киназы смешанного происхождения, опосредует передачу сигналов некроза ниже киназы RIP3. Клетка. 2012. 148 (1–2): 213–27. pmid: 22265413.
    23. 23. Хильдебранд Дж. М., Танцер М. С., Люсет И. С., Янг С. Н., Сполл С. К., Шарма П. и др. Активация псевдокиназы MLKL высвобождает домен пучка с четырьмя спиралями, чтобы вызвать локализацию мембраны и некроптотическую гибель клеток.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2014; 111 (42): 15072–7. pmid: 25288762; PubMed Central PMCID: PMC4210347.
    24. 24. Гонг Ю.Н., Гай С., Олаусон Х., Беккер Ю.Ю., Ян М., Фицджеральд П. и др. ESCRT-III действует ниже MLKL, регулируя гибель некроптозных клеток и ее последствия. Клетка. 2017; 169 (2): 286–300 e16. pmid: 28388412; PubMed Central PMCID: PMC5443414.
    25. 25. Кайзер WJ, Аптон JW, Mocarski ES. Рецептор-взаимодействующий белок, гомотипическое взаимодействие, мотив-зависимый контроль активации NF-каппа B через ДНК-зависимый активатор регуляторных факторов IFN.J Immunol. 2008. 181 (9): 6427–34. Epub 2008/10/23. pmid: 18941233; PubMed Central PMCID: PMC3104927.
    26. 26. Rebsamen M, Heinz LX, Meylan E, Michallet MC, Schroder K, Hofmann K и др. DAI / ZBP1 рекрутирует RIP1 и RIP3 через мотивы гомотипического взаимодействия RIP для активации NF-kappaB. EMBO Rep. 2009; 10 (8): 916–22. Epub 2009/07/11. pmid: 195; PubMed Central PMCID: PMC2726668.
    27. 27. Аптон Дж. В., Кайзер В. Дж., Мокарски Е. С.. Комплексы DAI / ZBP1 / DLM-1 с RIP3 для опосредования вирус-индуцированного запрограммированного некроза, на который нацелен мышиный цитомегаловирус vIRA.Клеточный микроб-хозяин. 2012. 11 (3): 290–7. pmid: 22423968; PubMed Central PMCID: PMC3531981.
    28. 28. Такаока А., Ван З., Чой М.К., Янаи Х., Негиси Х., Бан Т. и др. DAI (DLM-1 / ZBP1) — это цитозольный ДНК-сенсор и активатор врожденного иммунного ответа. Природа. 2007. 448 (7152): 501–5. Epub 2007/07/10. pmid: 17618271.
    29. 29. Thapa RJ, Ingram JP, Ragan KB, Nogusa S, Boyd DF, Benitez AA и др. DAI определяет геномную РНК вируса гриппа А и активирует зависимую от RIPK3 гибель клеток.Клеточный микроб-хозяин. 2016; 20 (5): 674–81. pmid: 27746097.
    30. 30. Maelfait J, Liverpool L, Bridgeman A, Ragan KB, Upton JW, Rehwinkel J. Зондирование вирусной и эндогенной РНК с помощью ZBP1 / DAI вызывает некроптоз. EMBO J. 2017; 36 (17): 2529–43. pmid: 28716805; PubMed Central PMCID: PMC5579359.
    31. 31. Dufour F, Sasseville AM, Chabaud S, Massie B, Siegel RM, Langelier Y. Субъединицы R1 рибонуклеотидредуктазы вируса простого герпеса типов 1 и 2 защищают клетки от апоптоза, индуцированного TNF-альфа и FasL, путем взаимодействия с каспазой-8.Апоптоз. 2011; 16 (3): 256–71. Epub 2010/11/26. pmid: 21107701.
    32. 32. Chabaud S, Sasseville AM, Elahi SM, Caron A, Dufour F, Massie B и др. Рибонуклеотидредуктазный домен субъединицы R1 рибонуклеотидредуктазы вируса простого герпеса 2 типа важен для антиапоптотической функции R1. J Gen Virol. 2007. 88 (Pt 2): 384–94. pmid: 17251554.
    33. 33. Menard C, Wagner M, Ruzsics Z, Holak K, Brune W, Campbell AE и др. Роль членов семейства гена цитомегаловируса мыши US22 в репликации в макрофагах.J Virol. 2003. 77 (10): 5557–70. pmid: 12719548; PubMed Central PMCID: PMC154053.
    34. 34. Аптон Дж. В., Кайзер В. Дж., Мокарски Е. С.. Вирусное подавление RIP3-зависимого некроза. Клеточный микроб-хозяин. 2010. 7 (4): 302–13. pmid: 20413098; PubMed Central PMCID: PMC4279434.
    35. 35. Кайзер WJ, Аптон JW, Mocarski ES. Вирусная модуляция запрограммированного некроза. Curr Opin Virol. 2013. 3 (3): 296–306. pmid: 23773332; PubMed Central PMCID: PMC3821070.
    36. 36. Чо Ю.С., Чалла С., Мокин Д., Дженга Р., Рэй Т.Д., Гилфорд М. и др.Управляемая фосфорилированием сборка комплекса RIP1-RIP3 регулирует запрограммированный некроз и вызванное вирусом воспаление. Клетка. 2009. 137 (6): 1112–23. pmid: 19524513; PubMed Central PMCID: PMC2727676.
    37. 37. Baker M, Shanmugam N, Pham CLL, Strange M, Steain M, Sunde M. Белок на основе RHIM: взаимодействия белков в микробной защите против запрограммированной гибели клеток из-за некроптоза. Semin Cell Dev Biol. 2018. Epub 2018/05/09. pmid: 29738881.
    38. 38. Аптон Дж. В., Кайзер В. Дж., Мокарски Е. С..Для подавления гибели клеток цитомегаловируса M45 требуется взаимодействие с RIP1, зависимое от мотива гомотипического взаимодействия (RHIM) с рецептор-взаимодействующим белком (RIP). J Biol Chem. 2008. 283 (25): 16966–70. pmid: 18442983; PubMed Central PMCID: PMC2427362.
    39. 39. Pham CL, Shanmugam N, Strange M, O’Carroll A, Brown JW, Sierecki E, et al. Вирусный M45 и белки, связанные с некроптозом, образуют гетеромерные амилоидные сборки. EMBO Rep.2019; 20 (2). Epub 2018/12/01. pmid: 30498077; PubMed Central PMCID: PMC6362354.
    40. 40. Ван Х, Ли И, Лю С., Ю Х, Ли Л., Ши С. и др. Прямая активация RIP3 / MLKL-зависимого некроза белком ICP6 вируса простого герпеса 1 (HSV-1) запускает противовирусную защиту хозяина. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2014; 111 (43): 15438–43. pmid: 25316792; PubMed Central PMCID: PMC4217423.
    41. 41. Гуо Х., Омото С., Харрис П.А., Фингер Дж. Н., Бертин Дж., Гоф П. Дж. И др. Вирус простого герпеса подавляет некроптоз в клетках человека. Клеточный микроб-хозяин. 2015; 17 (2): 243–51. pmid: 25674983.
    42. 42. Хуанг З., Ву С.К., Лян И, Чжоу Х, Чен В., Ли Л. и др. Связывание RIP1 / RIP3 с HSV-1 ICP6 инициирует некроптоз, чтобы ограничить распространение вируса у мышей. Клеточный микроб-хозяин. 2015; 17 (2): 229–42. pmid: 25674982.
    43. 43. Гуо Х., Гилли Р.П., Фишер А., Лейн Р., Ландштайнер В.Дж., Раган К.Б. и др. Независимый от вида вклад некроптоза, запускаемого ZBP1 / DAI / DLM-1, в защиту хозяина от HSV1. Cell Death Dis. 2018; 9 (8): 816. Epub 2018/07/28. pmid: 30050136; PubMed Central PMCID: PMC6062522.
    44. 44. Lembo D, Brune W. Занимаясь вирусной рибонуклеотидредуктазой. Trends Biochem Sci. 2009. 34 (1): 25–32. pmid: 189.
    45. 45. Heineman TC, Cohen JI. Делеция большой субъединицы рибонуклеотидредуктазы вируса ветряной оспы-опоясывающего лишая нарушает рост вируса in vitro. J Virol. 1994. 68 (5): 3317–23. pmid: 8151792; PubMed Central PMCID: PMC236822.
    46. 46. Адамсон В.Е., Макнаб Д., Престон В.Г., Риксон Ф.Дж. Мутационный анализ триплексного белка вируса простого герпеса VP19C.J Virol. 2006. 80 (3): 1537–48. Epub 2006/01/18. pmid: 16415029; PubMed Central PMCID: PMC1346951.
    47. 47. Омото С., Го Х, Талекар Г. Р., Робак Л., Кайзер В. Дж., Мокарски Е. С.. Подавление RIP3-зависимого некроптоза цитомегаловирусом человека. J Biol Chem. 2015. 290 (18): 11635–48. pmid: 25778401; PubMed Central PMCID: PMC4416866.
    48. 48. Веллер TH, Стоддард МБ. Внутриядерные тельца включения в культурах тканей человека, инокулированных жидкостью везикул ветряной оспы. J Immunol.1952; 68 (3): 311–9. Epub 1952/03/01. pmid: 14938547.
    49. 49. Campbell TM, McSharry BP, Steain M, Slobedman B, Abendroth A. Вирус ветряной оспы и вирус простого герпеса 1 по-разному модулируют экспрессию лиганда NKG2D во время продуктивной инфекции. J Virol. 2015; 89 (15): 7932–43. Epub 2015/05/23. pmid: 25995251; PubMed Central PMCID: PMC4505661.
    50. 50. Кристенсен Дж., Стейн М., Слобедман Б., Абендрот А. Дифференцированные клетки нейробластомы представляют собой высокоэффективную модель для изучения продуктивной инфекции нейрональных клеток вирусом ветряной оспы.J Virol. 2011. 85 (16): 8436–42. Epub 2011/06/03. pmid: 21632750; PubMed Central PMCID: PMC3147949.
    51. 51. Герада С., Стейн М., Макшарри Б.П., Слобедман Б., Абендрот А. ORF63 вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая человека защищает нейрональные и кератиноцитарные клеточные линии человека от апоптоза и изменяет его локализацию при индукции апоптоза. J Virol. 2018; 92 (12). Epub 2018/03/30. pmid: 29593042; PubMed Central PMCID: PMC5974485.
    52. 52. Кеннеди Дж. Дж., Стейн М., Слободман Б., Абендрот А.Инфекция и функциональная модуляция моноцитов и макрофагов человека вирусом ветряной оспы. J Virol. 2019; 93 (3). Epub 2018/11/09. pmid: 30404793; PubMed Central PMCID: PMC6340020.
    53. 53. Райхельт М., Брэди Дж., Арвин А.М. Цикл репликации вируса ветряной оспы-опоясывающего лишая: анализ кинетики экспрессии вирусного белка, синтеза генома и сборки вириона на одноклеточном уровне. J Virol. 2009. 83 (8): 3904–18. Epub 2009/02/06. pmid: 1

      97; PubMed Central PMCID: PMC2663235.
    54. 54. Cohrs RJ, Wischer J, Essman C, Gilden DH. Характеристика белков гена 21 и 29 вируса ветряной оспы в инфицированных клетках. J Virol. 2002. 76 (14): 7228–38. Epub 2002/06/20. pmid: 12072522; PubMed Central PMCID: PMC136324.
    55. 55. Campbell TM, McSharry BP, Steain M, Ashhurst TM, Slobedman B, Abendroth A. Вирус ветряной оспы продуктивно инфицирует естественные клетки-киллеры человека и манипулирует фенотипом. PLoS Pathog. 2018; 14 (4): e1006999. Epub 2018/05/01.pmid: 29709039; PubMed Central PMCID: PMC5953475.
    56. 56. Куриакосе Т., Ман С.М., Суббарао Малиредди Р.К., Карки Р., Кесавардхана С., Плейс ДЭ и др. ZBP1 / DAI — это врожденный датчик вируса гриппа, запускающий инфламмасому NLRP3 и пути запрограммированной гибели клеток. Sci Immunol. 2016; 1 (2): aag2045. pmid: 27

      2.
    57. 57. Jang KH, Jang T, Son E, Choi S, Kim E. Киназа-независимая роль ядерного RIPK1 в регуляции партанатов посредством физического взаимодействия с PARP1 при окислительном стрессе.Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2018; 1865 (1): 132–41. Epub 2017/10/11. pmid: 28993228.
    58. 58. Момпин М., Ли В., Ли Дж., Лааге С., Симер А.Б., Бозкурт Г. и др. Структура ядра некросомы RIPK1-RIPK3, человеческого гетероамилоидного сигнального комплекса. Клетка. 2018; 173 (5): 1244–53 e10. Epub 2018/04/24. pmid: 29681455; PubMed Central PMCID: PMC6002806.
    59. 59. Sunde M, Serpell LC, Bartlam M, Fraser PE, Pepys MB, Blake CC. Общая структура ядра амилоидных фибрилл по данным синхротронной дифракции рентгеновских лучей.J Mol Biol. 1997. 273 (3): 729–39. Epub 1997/11/14. pmid: 9356260.
    60. 60. Гамбин Ю., Полинковский М., Франсуа Б., Жиль Н., Бхумкар А., Сиреки Э. Конфокальная спектроскопия для изучения димеризации, олигомеризации и агрегации белков: практическое руководство. Int J Mol Sci. 2016; 17 (5). pmid: 27144560; PubMed Central PMCID: PMC4881481.
    61. 61. Finnen RL, Mizokami KR, Banfield BW, Cai GY, Simpson SA, Pizer LI, et al. Постентарные события ответственны за ограничение продуктивной инфекции вирусом ветряной оспы в клетках яичников китайского хомячка.J Virol. 2006. 80 (21): 10325–34. Epub 2006/10/17. pmid: 17041213; PubMed Central PMCID: PMC1641800.
    62. 62. Джурак И., Брюн В. Индукция апоптоза ограничивает межвидовую инфекцию цитомегаловируса. EMBO J. 2006; 25 (11): 2634–42. Epub 2006/05/12. pmid: 16688216; PubMed Central PMCID: PMC1478185.
    63. 63. Дейли-Бауэр Л.П., Робак Л., Кросби Л.Н., Маккормик А.Л., Фенг Й., Кайзер В.Дж. и др. Супрессоры смерти цитомегаловируса М36 и М45 мыши взаимодействуют для предотвращения воспаления, возникающего в результате путей запрограммированной антивирусной гибели клеток.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2017; 114 (13): E2786 – E95. pmid: 28292903; PubMed Central PMCID: PMC5380087.
    64. 64. Sloan E, Henriquez R, Kinchington PR, Slobedman B, Abendroth A. Ингибирование вирусом ветряной оспы-опоясывающего лишая пути NF-kappaB во время инфицирования дендритных клеток человека: роль открытой рамки считывания 61 как модулятора активности NF-kappaB. J Virol. 2012. 86 (2): 1193–202. pmid: 220
    65. ; PubMed Central PMCID: PMC3255823.
    66. 65. Muscolino E, Schmitz R, Loroch S, Caragliano E, Schneider C, Rizzato M, et al.Вирусы герпеса вызывают агрегацию и избирательную аутофагию сигнальных белков хозяина NEMO и RIPK1 в качестве механизма уклонения от иммунитета. Nat Microbiol. 2020; 5 (2): 331–42. Epub 2019/12/18. pmid: 31844296.
    67. 66. Ньютон К., Виклифф К.Е., Мальцман А., Даггер Д.Л., Штрассер А., Фам В.К. и др. RIPK1 ингибирует ZBP1-управляемый некроптоз во время развития. Природа. 2016; 540 (7631): 129–33. pmid: 27819682.
    68. 67. Лин Дж., Кумари С., Ким С., Ван Т.М., Ваксмут Л., Поликратис А. и др.RIPK1 противодействует ZBP1-опосредованному некроптозу, подавляя воспаление. Природа. 2016; 540 (7631): 124–8. pmid: 27819681.
    69. 68. Гершон МД, Гершон АА. VZV-инфекция кератиноцитов: образование бесклеточных инфекционных вирионов in vivo. Curr Top Microbiol Immunol. 2010; 342: 173–88. Epub 2010/03/13. pmid: 20225011; PubMed Central PMCID: PMC5408736.
    70. 69. Секстон CJ, Navsaria HA, Leigh IM, Powell K. Репликация вируса ветряной оспы в первичных кератиноцитах человека.J Med Virol. 1992. 38 (4): 260–4. Epub 1992/12/01. pmid: 1335482.
    71. 70. Тейлор С.Л., Моффат Дж. Ф. Репликация вируса ветряной оспы в культуре органов кожи человека. J Virol. 2005. 79 (17): 11501–6. Epub 2005/08/17. pmid: 16103201; PubMed Central PMCID: PMC1193618.
    72. 71. Худ С., Каннингем А.Л., Слободман Б., Арвин А.М., Соммер М.Х., Кинчингтон П.Р. и др. ORF63 вируса ветряной оспы-опоясывающего лишая подавляет апоптоз первичных нейронов человека. J Virol. 2006. 80 (2): 1025–31. 80/2/1025 [pii] pmid: 16379003.
    73. 72. Худ С, Каннингем А.Л., Слобедман Б., Боадл Р.А., Абендрот А. Сенсорные нейроны человека, инфицированные вирусом ветряной оспы, устойчивы к апоптозу, однако фибробласты крайней плоти человека чувствительны: свидетельства апоптотического ответа, специфичного для клеточного типа. J Virol. 2003. 77 (23): 12852–64. pmid: 14610206.
    74. 73. Чаудхури В., Соммер М., Раджамани Дж., Зербони Л., Арвин А.М. Функции капсидного белка ORF23 вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая в репликации вируса и патогенезе кожной инфекции.J Virol. 2008. 82 (20): 10231–46. Epub 2008/08/08. pmid: 18684828; PubMed Central PMCID: PMC2566272.
    75. 74. Цзяо Х., Ваксмут Л., Кумари С., Шварцер Р., Лин Дж., Эрен РО и др. Чувствительность к Z-нуклеиновой кислоте запускает ZBP1-зависимый некроптоз и воспаление. Природа. 2020; 580 (7803): 391–5. Epub 2020/04/17. pmid: 32296175.
    76. 75. Тишер Б.К., Кауфер Б.Б., Соммер М., Вуссоу Ф., Арвин А.М., Остерридер Н. Самоизлечивающийся инфекционный бактериальный клон искусственной хромосомы вируса ветряной оспы-опоясывающего лишая позволяет анализировать необходимый белок тегумента, кодируемый ORF9.J Virol. 2007. 81 (23): 13200–8. pmid: 172; PubMed Central PMCID: PMC2169085.
    77. 76. Стэнтон Р.Дж., Макшарри Б.П., Армстронг М., Томасек П., Уилкинсон Г.В. Реорганизация векторных систем аденовируса для обеспечения высокопроизводительного анализа функции генов. Биотехники. 2008. 45 (6): 659–62, 64–8. pmid: 19238796.
    78. 77. Brown JWP, Bauer A, Polinkovsky ME, Bhumkar A, Hunter DJB, Gaus K и др. Обнаружение одиночных молекул на портативном 3D-печатном микроскопе. Nat Commun.2019; 10 (1): 5662. Epub 2019/12/13. pmid: 31827096; PubMed Central PMCID: PMC6
    79. 7.

    новая иммуногенность окского вектора вакцины против ветряной оспы, экспрессирующего поверхностный антиген гепатита В | Журнал инфекционных болезней

    Аннотация

    Рекомбинантная вакцина против ветряной оспы Oka (ROka), экспрессирующая поверхностный антиген гепатита B (HBsAg), и субъединичная вакцина HBsAg (SHV) были использованы в качестве первичной и бустерной вакцины HBsAg в 3 комбинациях (SHV-SHV, SHV-ROka и ROka-SHV) в Гвинее. свиньи.Оценивали иммунные ответы на HBsAg и вирус ветряной оспы gE: gI. Эти 3 комбинации индуцировали аналогичные уровни пролиферационного ответа лимфоцитов на HBsAg. Из 3 комбинаций SHV-SHV индуцировал наиболее сильный ответ антител на петлю «a» HBsAg и на весь HBsAg. Его отношение титра антител к этой петле по сравнению с HBsAg было значительно выше, чем у SHV-ROka, что предполагает дополнительное распознавание конформационного эпитопа HBsAg в SHV-ROka. SHV-ROka индуцировала гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) к HBsAg и gE: gI, продуцируемым в инфицированных клетках.Таким образом, ROka индуцировал DTH в HBsAg и усиливал распознавание конформационного эпитопа. Вакцина против ветряной оспы ROka может служить новым вектором вакцины для индукции иммунного ответа Th2-типа.

    Считается, что в общей сложности около 200 миллионов человек во всем мире являются носителями вируса гепатита B (HBV), который вызывает острый и хронический гепатит, цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. Вакцинация полученной из крови и генно-инженерной вакциной субъединичного поверхностного антигена HBV (HBsAg) (SHV) используется для предотвращения инфекции HBV в группах высокого риска.Вакцина против ветряной оспы успешно используется для придания активного иммунитета без серьезных побочных реакций у пациентов с ослабленным иммунитетом [1], и она одобрена для общего применения в США. Вакцина против ветряной оспы индуцирует иммунитет к инфекции вируса ветряной оспы (VZV), которая характеризуется гуморальным ответом антител и клеточным иммунитетом, особенно гиперчувствительностью замедленного типа (ГЗТ), за счет кожной реакции с антигеном кожной пробы ветряной оспы [2 ]. Вакцина против ветряной оспы использовалась для экспрессии чужеродных генов, таких как гликопротеин вируса Эпштейна-Барра [3] и гликопротеин D вируса простого герпеса [4].Мы сконструировали и охарактеризовали рекомбинантную вакцину против ветряной оспы (ROka), экспрессирующую HBsAg [5, 6]. Иммуногенность ROka аналогична таковой у SHV в отношении индукции антител к HBsAg на моделях VZV-инфекции на морских свинках [2, 5].

    В этом исследовании, используя HBsAg в качестве иммунологического маркера, мы охарактеризовали иммуногенность вакцины против ветряной оспы Окской оспы как вектора вакцины. HBsAg как ROka, так и SHV произошел от одного и того же гена HBsAg (подтип adr ) [5, 6]. Мы сравнили гуморальный и клеточно-опосредованный иммунный ответ на HBsAg, индуцированный ROka и SHV.Антитела, индуцированные группами иммунизации, сравнивали с использованием гликозилированного и негликозилированного HBsAg и его составляющих 16 видов пептидов. Несоответствие антител к HBsAg и эпитопу линейной «а» петли [7] свидетельствует об усилении узнавания конформационного эпитопа HBsAg [8] при иммунизации ROka. Мы также охарактеризовали обратную зависимость между снижением продукции антител и индукцией DTH, представляющую ответ макрофагального типа клеток Th2 на вакцинный вектор Oka против ветряной оспы.

    Материалы и методы

    Вакцина

    SHV для использования человеком был предоставлен Исследовательским фондом микробных заболеваний Университета Осаки, Суита, Япония. SHV содержит 10 мкл г HBsAg, полученного из дрожжей с квасцами. ROka получали из инфицированных эмбриональных клеток легких человека, как описано в другом месте [5]. Морских свинок иммунизировали подкожно 1 дозой SHV или 15000 БОЕ ROka.

    Антигены

    Негликозилированный HBsAg, полученный из дрожжей, был предоставлен Исследовательским фондом микробных заболеваний Университета Осаки.Гликозилированный HBsAg, полученный из сыворотки носителей HBV [9], был приготовлен из набора HBsAg-позитивного контроля (International Reagent, Кобе, Япония) для теста на обратную пассивную он-магглютинацию (RPHA) [5]. VZV gE: gI очищали путем нанесения лизата инфицированных вакциной против ветряной оспы клеточного лизата на аффинную колонку, сопряженную с моноклональным антителом против gE [10, 11].

    График вакцинации и иммунизации

    Самок морских свинок (линия Yodo) массой ~ 280 г (Japan Rabbit Center, Ibaraki, Japan) использовали для иммунизации SHV или инфицирования ROka [2, 5, 11].ROka и SHV использовались в качестве первичной и бустерной HBsAg-вакцин для 5 морских свинок с 3 комбинациями SHV-SHV, SHV-ROka и ROka-SHV с 4-недельными интервалами. PBS использовали в качестве контрольной вакцины для иммунизации в качестве первичной и бустерной вакцины по одному и тому же графику (PBS-PBS). Иммунные ответы на HBsAg и gE: gI оценивали через 4 недели после 2-й вакцинации.

    Анализ пролиферации лимфоцитов

    Мононуклеарные клетки селезенки были отделены с использованием градиентов плотности фиколл-гипак и ресуспендированы в полной среде (RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и 5 × 10 -6 2-меркаптоэтанол M ) для пролиферация лимфоцитов [11].Вкратце, 10 мкл мкл очищенного HBsAg (100 мкл мкг / мл) или gE: gI (100 мкг мкг / мл) высевали на каждую лунку 96-луночного планшета и 50 мкл Добавляли мкл мононуклеарных клеток (× 10 6 клеток / мл). Смеси культивировали в трех повторностях в течение 5 дней и в течение последних 18 часов подвергали импульсному воздействию 5 мкл Ки / лунку [ 3 H] тимидина (84 Ки / ммоль; Moravek Biochemicals, Бреа, Калифорния) для определения инкорпорированная радиоактивность. Результаты выражали в виде индекса стимуляции путем деления радиоактивности стимулированной культуры на радиоактивность ее нестимулированного аналога.

    Кожная реакция

    Морским свинкам вводили внутрикожно в 3 места на спине 0,1 мл HBsAg (1 мкл г) и gE: gI (3,2 мкл г) после удаления волос с помощью химического средства для депиляции [2, 11]. Эритематозную область измеряли через 8, 24 и 48 часов, и ее площадь считали эллипсом и выражали следующей формулой: площадь = π [(длинный диаметр × короткий диаметр) / 4].

    Анализ антител

    сыворотки были протестированы на HBsAg и gE: gI с помощью теста PH A (International Reagent) и ELISA, соответственно [5, 11].Сыворотки разбавляли в 100 раз PBS, содержащим 2% обезжиренного молока, и вносили в каждую лунку, обработанную 0,5 мкл г gE: gI, для определения титра антител к gE: gI в ELISA. Затем козьи IgG против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой (целая молекула; Organon Teknika / Cappel, Durham, NC), распределяли по лункам, и реакцию визуализировали с использованием раствора субстрата из набора для общего иммуноглобулина-EIA для гепатита А. (Денка Сейкен, Ниигата, Япония). Антитела к HBsAg измеряли с помощью ELISA, используя HBsAg, полученный из сыворотки носителей HBV (гликозилированный HBsAg) и дрожжей (негликозилированный HBsAg) [6, 9].HBsAg наносили в лунки в концентрации 1 мкл, г / 50- мкл, мкл лунки, и проводили дальнейшую реакцию, как описано выше.

    Пептидный ELISA

    Для определения антигенного эпитопа HBsAg в 96-луночных планшетах из набора для синтеза нерасщепляемых пептидов Multipin (Chiron, Сан-Диего) в соответствии с инструкциями производителя готовили 16 видов пептидов, составляющих всю часть HBsAg. Титр антител к каждому пептиду определяли, как описано для ELISA.

    Статистический анализ

    Статистическая значимость всех данных оценивалась с помощью непарного теста Стьюдента t . P <0,05 считалось статистически значимым.

    Результаты

    Иммунный ответ на VZV gE: gI

    Мы сравнили иммунный ответ на gE: gI среди 4 групп иммунизации (таблица 1, рисунок 1). Поскольку группы иммунизации SHV-SHV и PBS-PBS не были иммунизированы VZV, иммунного ответа на gE: gI не наблюдалось.Иммунизация SHV-ROka и ROka-SHV вызвала аналогичные реакции пролиферации лимфоцитов и кожные реакции на gE: gI (рисунок 1). Кожная реакция продолжалась через 48 часов после инокуляции и представляла собой типичную ГЗТ с течением времени. Как показано в таблице 1, иммунизация SHV-ROka индуцировала значительно более высокие титры антител против gE: gI, чем иммунизация ROka-SHV ( P <0,01). Эта разница может быть вызвана снижением титра антител через 4–8 недель после иммунизации ROka.

    Таблица 1

    Титр антител к вирусу ветряной оспы (VZV) gE: gI и поверхностному антигену гепатита B (HBsAg) в 3 группах иммунизации и 1 группе плацебо.

    Таблица 1

    Титр антител к вирусу ветряной оспы (VZV) gE: gI и поверхностный антиген гепатита B (HBsAg) в 3 группах иммунизации и 1 группе плацебо.

    Рисунок 1

    Иммунный ответ на вирус ветряной оспы (VZV) gE: gI и поверхностный антиген гепатита B (HBsAg) через 4 недели после бустерной иммунизации. Иммунный ответ на VZV gE: gI оценивали по ответу пролиферации лимфоцитов (A) и кожной реакции (B) .Ответ на HBsAg оценивали по ответу пролиферации лимфоцитов (C) и кожной реакции (D) . Результаты представляют собой среднее значение + SE для 5 морских свинок. SHV, субъединичная вакцина HBsAg; ROka, рекомбинантная вакцина против ветряной оспы Oka (ROka). Никакого иммунного ответа на gE: gI не наблюдалось в группе SHV-SHV или PBS-PBS ( P <0,05; A, B ) или к HBsAg в группе PBS-PBS ( P <0,05 или 0,01; C, D ). * P <0,05 по сравнению с ROka-SHV; ** <.01 по сравнению с ШВ-ШВ и Рока-ШВ через 24 и 48 ч.

    Рисунок 1

    Иммунный ответ на вирус ветряной оспы (VZV) gE: gI и поверхностный антиген гепатита B (HBsAg) через 4 недели после повторной иммунизации. Иммунный ответ на VZV gE: gI оценивали по ответу пролиферации лимфоцитов (A) и кожной реакции (B) . Ответ на HBsAg оценивали по ответу пролиферации лимфоцитов (C) и кожной реакции (D) . Результаты представляют собой среднее значение + SE для 5 морских свинок.SHV, субъединичная вакцина HBsAg; ROka, рекомбинантная вакцина против ветряной оспы Oka (ROka). Никакого иммунного ответа на gE: gI не наблюдалось в группе SHV-SHV или PBS-PBS ( P <0,05; A, B ) или к HBsAg в группе PBS-PBS ( P <0,05 или 0,01; C, D ). * P <0,05 по сравнению с ROka-SHV; ** <0,01 по сравнению с SHV-SHV и ROka-SHV через 24 и 48 часов.

    Иммунный ответ на HBsAg

    Мы сравнили иммуногенность ROka и SHV (таблица 1, рисунок 1).Комбинация PBS-PBS не вызывала иммунного ответа на HBsAg. 3 комбинации иммунизации индуцировали аналогичный уровень пролиферации лимфоцитов (рисунок 1C). Кожная реакция на HBsAg в группах SHV-SHV и ROka-SHV показала типичную реакцию типа Артуса с течением времени, и обе группы иммунизации, в отличие от группы SHV-ROka, не смогли вызвать реактивность через 24 и 48 часов. ( P <0,01). Иммунизация SHV-ROka вызвала сильную кожную реакцию на HBsAg через 24 и 48 ч, и профиль реакции во времени был аналогичен профилю реакции gE: gI, наблюдаемому при иммунизации ROka.Таким образом, только иммунизация SHV-ROka вызывала кожную реакцию, характерную для DTH, против HBsAg.

    Ответ антител на HBsAg

    В таблице 1 показаны результаты продукции антител к HBsAg и составляющим его пептидам. Антитела к HBsAg, оцененные RPHA с использованием сывороточного HBsAg, были значительно выше в группе SHV-SHV, чем в других комбинациях ( P <0,01). Гликозилированный и негликозилированный HBsAg использовали в качестве тестовых антигенов для измерения антител к HBsAg; с помощью ELISA комбинаций иммунизация SHV-SHV индуцировала самую сильную продукцию гликозилированных антител ( P <.05) и негликозилированный HBsAg ( P <0,01), что согласуется с результатом RPHA.

    Все группы, иммунизированные вакцинами HBsAg, ответили на эпитоп основной петли «а» HBsAg; наблюдалась слабая реакция на другие пептиды. Не было значительных различий в профиле ответа антител на каждый пептид среди 3 групп иммунизации HBsAg. Однако титр антител к эпитопу основной петли «а» HBsAg был самым высоким в группе SHV-SHV ( P <0,05) и был сопоставим в группах ROka-SHV и SHV-ROka.

    Не было значительной разницы в соотношении антител к негликозилированному и гликозилированному HBsAg среди 3 групп. Однако отношение антитела к пептиду петли «а» по сравнению с негликозилированным или гликозилированным HBsAg было наименьшим в группе иммунизации SHV-ROka и было значительно ниже в группе SHV-ROka, чем в группе SHV-SHV ( P < 0,05). Это предполагает, что антитела в группе иммунизации SHV-ROka могут распознавать эпитоп, отличный от эпитопа линейной петли «а», для достижения общего ответа антител на весь HBsAg.Разница может быть не связана с гликозилированием HBsAg, как показывает сравнение соотношений антител между гликозилированным и негликозилированным HBsAg. Следовательно, дополнительное распознавание конформационного эпитопа может объяснить несоответствие соотношения антитела к петлевому пептиду «а» и HBsAg, предполагая повышенное узнавание конформационного эпитопа в дополнение к линейному эпитопу «а» HBsAg в Группа иммунизации SHV-ROka.

    Обсуждение

    Мы охарактеризовали иммуногенность ROka как вектора вакцины против ветряной оспы, используя HBsAg в качестве маркера иммунного ответа на модели морской свинки.VZV gE: gI является основной мишенью иммунного ответа при инфекции VZV, а кожная реакция на антиген VZV, включая gE: gI, индуцируется у морских свинок [2, 11]. Иммунизация SHV-ROka индуцировала DTH и продукцию антител к HBsAg и gE: gI. Напротив, иммунизация SHV-SHV давала наибольшую продукцию антител к HBsAg без DTH. Вторая бустерная иммунизация с помощью ROka и SHV вызвала типичный пример иммунного отклонения [12] между DTH и ответом антител в этих 2 группах.

    Макрофаги и клетки Лангерганса в коже опосредуют кожную реакцию [13].VZV разрастается в коже. Следовательно, иммунный ответ, опосредованный кожными макрофагами, включая Лангерганса и дендритные клетки, может вызывать сильную кожную реакцию. Они могут высвобождать интерлейкин-12 при стимуляции антигенами, экспрессируемыми в VZV-инфицированных клетках, и могут активировать клетки Th2, что приводит к индукции Th2-доминантного ответа, такого как DTH [12–14]. Таким образом, экспрессия вирусных антигенов в инфицированных клетках может вызывать значительные различия в процессе распознавания антигена, такие как усиленное распознавание конформационного эпитопа и индукция DTH, как показано в этом исследовании.

    Ответ Th2-типа важен для выведения вируса и выздоровления от хронического гепатита B [15]. ROka индуцировал Th2-доминантный иммунный ответ на HBsAg. Следовательно, эта рекомбинантная вакцина может помочь улучшить иммунный статус к HBV у людей с хроническим гепатитом B. Однако, поскольку ответ Th2 также важен в патогенезе повреждения клеток печени, следует тщательно контролировать функцию печени. В целом вакцинация этой рекомбинантной вакциной против ветряной оспы может улучшить иммунный статус пациентов с хроническим гепатитом B и, таким образом, иметь положительный эффект в снижении активности гепатита.

    Это исследование показало, что вектор вакцины против ветряной оспы Ока индуцировал иммунный ответ типа VZV на HBsAg, особенно ответ типа Th2, что оценивалось по снижению продукции антител и индукции DTH. Вектор вакцины против ветряной оспы Oka может вызывать ответ Th2-типа на чужеродный антиген. Этот ответ полезен для улучшения клинического статуса пациентов, например, с хроническим гепатитом В. Кроме того, введение клеточного иммунитета с помощью этой живой рекомбинантной вакцины может быть полезно для будущей разработки вакцины, особенно для вирусов иммунодефицита человека и гепатита С, у которых гуморальный иммунитет, создаваемый традиционным подходом к вакцине из чистого белка, неэффективен.

    Благодарности

    Мы благодарим Жаклин Браун за помощь редактора и Фонд исследований микробных заболеваний Университета Осаки за предоставление HBsAg и SHV.

    Список литературы

    1.,.

    Живая аттенуированная вакцина против ветряной оспы

    ,

    Annu Rev Microbiol

    ,

    1996

    , vol.

    50

    (стр.

    59

    100

    ) 2.,,.

    Биологическая и иммунологическая характеристика растворимого антигена кожных тестов вируса ветряной оспы

    ,

    J Infect Dis

    ,

    1984

    , vol.

    149

    (стр.

    501

    4

    ) 3.,,, Et al.

    Вирус ветряной оспы как живой вектор для экспрессии чужеродных генов

    ,

    Proc Natl Acad Sci USA

    ,

    1987

    , vol.

    84

    (стр.

    3896

    900

    ) 4.,,,,.

    Иммунизация рекомбинантным вирусом ветряной оспы, экспрессирующим гликопротеин D вируса простого герпеса 2 типа, снижает тяжесть генитального герпеса у морских свинок

    ,

    J Virol

    ,

    1995

    , vol.

    69

    (стр.

    8109

    13

    ) 5.,,, Et al.

    Разработка иммуногенной рекомбинантной вакцины против ветряной оспы, экспрессирующей поверхностный антиген вируса гепатита В

    ,

    J Gen Virol

    ,

    1991

    , vol.

    72

    (стр.

    1393

    9

    ) 6.,,, Et al.

    Процессинг поверхностного антигена вируса гепатита В, экспрессируемого рекомбинантным вирусом ветряной оспы Ока

    ,

    J Gen Virol

    ,

    1992

    , vol.

    73

    (стр.

    1401

    7

    ) 7.,,, И др.

    Иммунный ответ на синтетические пептидные аналоги поверхностного антигена гепатита В, специфичные для детерминанты

    ,

    Proc Natl Acad Sci USA

    ,

    1982

    , vol.

    79

    (стр.

    4400

    4

    ) 8.,,.

    Австралийский антиген (антиген гепатита В): конформационный антиген, зависящий от дисульфидных связей

    ,

    Science

    ,

    1972

    , vol.

    178

    (стр.

    1300

    1

    ) 9.,,,.

    Углеводы в антигене гепатита В

    ,

    Nature

    ,

    1973

    , т.

    243

    (стр.

    260

    2

    ) 10.,,, Et al.

    Функции очищенных gB, gE: gI и gH: gL и их сиалиловых остатков при инфекции вирусом ветряной оспы

    ,

    Arch Virol

    ,

    1997

    , vol.

    142

    (стр.

    2295

    301

    ) 11.,,, Et al.

    Иммунный ответ на гликопротеины вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая у морских свинок, инфицированных окской вакциной против ветряной оспы

    ,

    Vaccine

    ,

    1998

    , vol.

    16

    (стр.

    1263

    9

    ) 12 ..

    Взаимосвязь между презентацией антигена, цитокинами, иммунным отклонением и аутоиммунным заболеванием

    ,

    J Exp Med

    ,

    1995

    , vol.

    182

    (стр.

    279

    82

    ) 13.,,. ,,.

    Функциональная анатомия иммунных ответов

    ,

    Клеточная и молекулярная иммунология

    ,

    1997

    3-е изд

    Филадельфия

    WB Saunders

    (стр.

    231

    46

    ) 14.,,,,,.

    Продукция интерлейкина (IL) -10, IL-12 и интерферона- α в первичных иммунных ответах и ​​иммунных ответах памяти на вирус ветряной оспы

    ,

    J Infect Dis

    ,

    1998

    , vol.

    178

    (стр.

    940

    8

    ) 15.,,,,,.

    Индукция интерлейкином-12 цитокинов Th2 важна для выведения вируса при хроническом гепатите B

    ,

    J Clin Invest

    ,

    1997

    , vol.

    99

    (стр.

    3025

    33

    )

    © 2000 Американского общества инфекционистов

    Оспа обезьян

    Оспа обезьян — это вирусный зооноз (вирус, передающийся человеку от животных) с симптомами, аналогичными тем, которые наблюдались в прошлом у больных оспой, хотя клинически протекает менее серьезно.С искоренением оспы в 1980 г. и последующим прекращением вакцинация против оспы, он стал наиболее важным ортопоксвирусом. Оспа обезьян встречается в Центральной и Западной Африке, часто в непосредственной близости от тропических лесов.

    Вспышки

    Оспа обезьян была впервые выявлена ​​у людей в 1970 году в Демократической Республике Конго (тогда известной как Заир) у 9-летнего мальчика в регионе, где оспа была ликвидирована в 1968 году. зарегистрированы случаи заболевания в сельской местности, в тропических лесах. регионы бассейна Конго, особенно в Демократической Республике Конго, где он считается эндемичным.

    С 1970 года случаи заражения людей оспой обезьян были зарегистрированы из 11 африканских стран — Бенина, Камеруна, Центральной Азии. Африканская Республика, Демократическая Республика Конго, Габон, Кот-д’Ивуар, Либерия, Нигерия, Республика Конго, Сьерра-Леоне и Южный Судан. В 2017 году в Нигерии произошла крупнейшая задокументированная вспышка болезни, через 40 лет после последней подтвержденной вспышки. кейс. Истинное бремя оспы обезьян неизвестно. Например, в 1996–1997 годах в Демократической Республике Конго подозревалась крупная вспышка оспы обезьян, однако с более низким уровнем смертности и более высоким уровнем заболеваемости, чем обычно.Некоторые образцы пациентов дали положительный результат на вирус ветряной оспы, а некоторые из них содержали вирусы ветряной оспы и оспы обезьян. Одновременные вспышки ветряной оспы и оспы обезьян могут объяснить изменение динамики передачи в этом случае.

    Вирус несколько раз экспортировался из Африки. Весной 2003 года случаи оспы обезьян были подтверждены в Соединенных Штатах Америки. Сообщалось, что большинство пациентов тесно контактировали с домашними луговыми собачками, зараженными африканскими грызунами. которые были ввезены в страну из Ганы.Недавно оспа обезьян была перенесена в Израиль в сентябре 2018 г., в Соединенное Королевство в сентябре 2018 г. и декабре 2019 г. и в Сингапур в мае 2019 г. путешественниками из Нигерии, которые заболели оспой обезьян. после прибытия. Медицинский работник заразился и заболел.

    Были идентифицированы две различные генетические клады вируса — бассейн Конго и западноафриканские клады, причем первая оказалась более вирулентной и передаваемой. Считается, что географическое разделение между двумя кладами Камерун, поскольку это единственная страна, где были обнаружены обе клады вируса оспы обезьян.

    Передача

    Инфекция в индексных случаях возникает в результате прямого контакта с кровью, биологическими жидкостями или поражениями кожи или слизистых оболочек инфицированных животных. В Африке доказательства заражения вирусом оспы обезьян были обнаружены у многих животных, в том числе у канатных белок, древесных белок, Гамбийские браконьеры добывали крыс, соней, различных видов обезьян и других. Естественный резервуар обезьяньей оспы еще не определен, хотя наиболее вероятны грызуны. Употребление в пищу неправильно приготовленного мяса и других продуктов животного происхождения от инфицированных животных. это возможный фактор риска.

    Вторичная передача или передача от человека человеку относительно ограничена. Заражение может возникнуть в результате тесного контакта с респираторными выделениями, поражениями кожи инфицированного человека или недавно зараженными предметами. Передача инфекции через капельные респираторные частицы обычно требует продолжительного личного контакта, что подвергает медицинских работников и членов домохозяйств активным заболеванием большему риску. Самая длинная задокументированная цепочка передачи в сообществе — шесть последовательных передач от человека к человеку. инфекции.Передача может также происходить через плаценту от матери к плоду (врожденная оспа обезьян).

    Признаки и симптомы

    Инкубационный период (интервал от заражения до появления симптомов) оспы обезьян обычно составляет от 6 до 13 дней, но может колебаться от 5 до 21 дня.

    Инфекцию можно разделить на два периода:

    • период инвазии (длится 0-5 дней), характеризующийся лихорадкой, сильной головной болью, лимфаденопатией (отек лимфатических узлов), болью в спине, миалгией (мышечные боли) и сильная астения (недостаток энергии).Лимфаденопатия — отличительная черта оспы обезьян по сравнению с другими заболеваниями, которые изначально могут выглядеть одинаково (ветряная оспа, корь, оспа).
    • кожная сыпь обычно начинается в течение 1-3 дней после появления лихорадки. Сыпь, как правило, больше сосредоточена на лице и конечностях, чем на туловище. Поражает лицо (в 95% случаев), ладони рук и подошвы стоп (в 75% случаев). Также поражаются слизистые оболочки полости рта (в 70% случаев), гениталий (30%) и конъюнктивы (20%), а также роговица.Сыпь последовательно развивается от пятен (поражения с плоским основанием) до папул (слегка приподнятые твердые поражения), пузырьков (поражения, заполненных прозрачной жидкостью), пустул (поражений, заполненных желтоватой жидкостью) и корок, которые высыхают и отпадают. Количество очагов варьируется от нескольких до нескольких тысяч. В тяжелых случаях поражения могут сливаться до тех пор, пока не отклеятся большие участки кожи.

    Оспа обезьян обычно проходит самостоятельно, симптомы которой сохраняются от 2 до 4 недель.Тяжелые случаи чаще встречаются у детей и связаны со степенью заражения вирусом, состоянием здоровья пациента и характером осложнений. Осложнения оспы обезьян могут включать вторичные инфекции, бронхопневмонию, сепсис, энцефалит и инфекцию роговицы с последующей потерей зрения.

    Люди, живущие в лесных районах или вблизи них, могут иметь косвенное или незначительное воздействие на инфицированных животных, что может приводить к субклинической (бессимптомной) инфекции.

    Летальность от оспы обезьян колеблется от 0 до 11% среди населения в целом и выше среди детей раннего возраста.Кроме того, люди моложе 40 или 50 лет (в зависимости от страны) могут быть более восприимчивыми к оспе обезьян в результате прекращения плановой вакцинации против оспы во всем мире после ликвидации оспы.

    Диагноз

    Клинический дифференциальный диагноз, который необходимо учитывать, включает другие заболевания с сыпью, такие как ветряная оспа, корь, бактериальные кожные инфекции, чесотка, сифилис и аллергии, связанные с приемом лекарств. Лимфаденопатия на продромальной стадии болезни может быть клиническим признаком, позволяющим отличить обезьянью оспу от ветряной или натуральной оспы.Если есть подозрение на оспу обезьян, медицинские работники должны собрать соответствующий образец и безопасно доставить его в лабораторию с соответствующими возможностями. Подтверждение оспы обезьян зависит от типа и качества образца и типа лабораторного исследования. Таким образом, образцы должны быть упакованы и отправлены в соответствии с национальными и международными требованиями. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является предпочтительным лабораторным тестом, учитывая ее точность и чувствительность. Для этого оптимальные образцы для диагностики оспы обезьян берут из поражений кожи — кровли или жидкости из пузырьков и пустул, а также из сухих корок.По возможности, возможна биопсия. Образцы поражений следует хранить в сухой стерильной пробирке (без среды для переноса вирусов) и хранить в холоде. ПЦР-анализы крови обычно неубедительны из-за короткой продолжительности виремии по сравнению со сроком взятия образцов после появления симптомов, и их не следует обычно брать у пациентов.

    Поскольку ортопоксвирусы обладают серологической перекрестной реактивностью, методы обнаружения антигенов и антител не обеспечивают подтверждения, специфичного для оспы обезьян. Поэтому серологические методы и методы обнаружения антигенов не рекомендуются для диагностики или расследования случаев, когда ресурсы ограничены.Кроме того, недавняя или удаленная вакцинация вакциной против коровьей оспы (например, всех, кто вакцинирован до искоренения оспы или недавно вакцинированных из-за повышенного риска, например, сотрудников лаборатории ортопоксвируса) может привести к ложноположительным результатам.

    Для интерпретации результатов анализов очень важно, чтобы информация о пациенте была предоставлена ​​вместе с образцами, включая: а) дату начала лихорадки, б) дату появления сыпи, в) дату сбора образца, г) текущее состояние индивидуальный (стадия высыпания) и д) возраст.

    Лечение и вакцина

    В настоящее время не существует рекомендованного специального лечения оспы обезьян. Вакцинация против оспы вакциной против оспы была продемонстрирована в нескольких обсервационных исследованиях как примерно 85% эффективности в предотвращении оспы обезьян. Таким образом, предварительная вакцинация детей от оспы может привести к более легкому течению болезни.

    Однако в настоящее время оригинальные противооспенные вакцины (первого поколения) больше не доступны для широкой публики. Более новая вакцина на основе осповакцины была одобрена для профилактики оспы и оспы обезьян в 2019 году и также еще не получила широкого распространения в государственном секторе.

    Естественный хозяин вируса оспы обезьян

    Различные виды животных были идентифицированы как восприимчивые к инфекции вируса оспы обезьян в ходе лабораторных экспериментов, вспышек среди содержащихся в неволе животных и полевых исследований. Сюда входят белки-веревочки, белки-белки, гамбийские крысы, убитые браконьерами, сони, приматы и другие виды. Сохраняются сомнения в естественной истории вируса, и необходимы дальнейшие исследования для определения точного резервуара (резервуаров) вируса оспы обезьян и того, как он сохраняется в природе.

    Профилактика

    Повышение осведомленности о факторах риска и информирование людей о мерах, которые они могут предпринять для снижения воздействия вируса, является основной стратегией профилактики оспы обезьян. В настоящее время проводятся научные исследования для оценки возможности и целесообразности использования вакцины против осповакцины для профилактики оспы обезьян и борьбы с ней. Некоторые страны имеют или разрабатывают политику использования вакцины против осповакцины для предотвращения инфицирования, например, среди сотрудников лабораторий и медицинских работников, которые могут подвергаться риску заражения.

    Снижение риска передачи зоонозов

    Большинство инфекций человека возникает в результате первичной передачи от животного человеку. Следует избегать незащищенного контакта с дикими животными, особенно с больными или мертвыми, в том числе с их мясом, кровью и другими частями. Кроме того, все продукты, содержащие мясо животных или его части, перед употреблением должны быть тщательно приготовлены.

    Снижение риска передачи инфекции от человека к человеку

    Эпиднадзор и быстрое выявление новых случаев имеют решающее значение для сдерживания вспышки.Во время вспышек оспы обезьян тесный контакт с больными оспой обезьян является наиболее значительным фактором риска заражения вирусом оспы обезьян. Медицинские работники и члены семьи подвергаются большему риску заражения.

    Медицинские работники, ухаживающие за пациентами с подозрением или подтвержденной инфекцией вируса оспы обезьян или работающие с их образцами, должны соблюдать стандартные меры инфекционного контроля. Если возможно, для ухода за пациентом следует выбирать лиц, ранее вакцинированных против оспы.

    Образцы, взятые у людей и животных с подозрением на инфицирование вирусом оспы обезьян, должны обрабатываться обученным персоналом, работающим в лабораториях с соответствующим оборудованием. Образцы от пациентов должны быть безопасно подготовлены к транспортировке в тройной упаковке в соответствии с рекомендациями ВОЗ по транспортировке инфекционных веществ (категория A).

    Предотвращение распространения оспы обезьян за счет ограничений на торговлю животными

    Некоторые страны ввели правила, ограничивающие импорт грызунов и нечеловеческих приматов.

    Животные, содержащиеся в неволе, потенциально инфицированные оспой обезьян, должны быть изолированы от других животных и немедленно помещены в карантин. Любые животные, которые могли контактировать с инфицированным животным, должны быть помещены в карантин, с ними следует обращаться со стандартными мерами предосторожности и наблюдать за симптомами оспы обезьян в течение 30 дней.

    Как оспа обезьян связана с оспой

    Клиническая картина оспы обезьян напоминает оспу — родственную ортопоксвирусную инфекцию, искорененную во всем мире.Оспа передавалась легче и чаще приводила к летальному исходу, так как около 30% пациентов умерли. Последний случай естественной оспы был зарегистрирован в 1977 году, а в 1980 году оспа была объявлена ​​искорененной во всем мире после глобальной кампании вакцинации. Прошло 40 или более лет с тех пор, как все страны прекратили плановую вакцинацию против оспы вакциной на основе осповакцины. Поскольку вакцина против оспы также защищает от оспы обезьян в Западной и Центральной Африке, невакцинированные популяции теперь также более восприимчивы к инфекции вируса оспы обезьян.

    В то время как натуральная оспа больше не возникает естественным путем, глобальный сектор здравоохранения сохраняет бдительность в случае ее возможного повторного появления в результате естественных механизмов, лабораторных аварий или преднамеренного выброса. Чтобы обеспечить глобальную готовность в случае повторного появления оспы, разрабатываются новые вакцины, средства диагностики и противовирусные препараты. Вакцина против оспы третьего поколения одобрена для профилактики оспы и оспы обезьян. Также разрабатываются противовирусные препараты. Теперь они также могут оказаться полезными для профилактики оспы обезьян и борьбы с ней.

    Ответные меры ВОЗ

    ВОЗ поддерживает государства-члены в проведении мероприятий по эпиднадзору, обеспечению готовности и реагированию на вспышки оспы обезьян в пострадавших странах.

    Различные подходы к вакцине против коронавируса

    РНК для

    шипованный белок

    РНК для

    шипованный белок

    РНК для

    шип

    белок

    Ученые разрабатывают более 100 вакцин против коронавируса с использованием ряда методов, некоторые из которых хорошо зарекомендовали себя, а некоторые из них никогда ранее не были одобрены для медицинского использования.

    Большинство этих вакцин нацелены на так называемые белки-шипы, которые покрывают вирус и помогают ему проникать в клетки человека. Иммунная система может вырабатывать антитела, которые цепляются за белки-шипы и останавливают вирус.

    Успешная вакцина против коронавируса SARS-CoV-2 научит иммунную систему людей вырабатывать антитела против вируса, не вызывая болезни.

    Цельновирусные вакцины

    Вакцины, которые модифицируют весь коронавирус, чтобы вызвать иммунный ответ.

    Инактивированные и живые аттенуированные вакцины

    Большинство вакцин, используемых сегодня, содержат инактивированную или ослабленную форму вируса, не способного вызывать заболевание. Когда иммунные клетки сталкиваются с ними, они вырабатывают антитела.

    Создание этих вакцин означает выращивание вирусов — и многих из них. Вакцины против гриппа обычно выращивают в куриных яйцах, а другие вакцины выращивают в резервуарах, заполненных плавающими клетками. Для производства партии новых вакцин на эти процедуры могут уйти месяцы.

    ПРИМЕРЫ: Все обычные вакцины против гриппа, ветрянки, кори, эпидемического паротита и краснухи попадают в эту категорию.

    КОМПАНИИ, РАЗРАБОТЧИВАЮЩИЕ ВАКЦИНЫ от SARS-COV-2: Синовац и другие.

    Генетические вакцины

    Вакцины, в которых используется часть генетического кода коронавируса.

    ДНК для

    шипованный белок

    ДНК для

    шипованный белок

    ДНК для

    шипованный белок

    ДНК-вакцины

    Ряд экспериментальных вакцин против коронавируса не доставляют цельные вирусы.Вместо этого они предоставляют генетические инструкции для создания вирусного белка. Затем белок может стимулировать иммунную систему к выработке антител и помогать укреплять другие средства защиты от коронавируса.

    Один из этих генетических подходов известен как ДНК-вакцина. Круг сконструированной ДНК доставляется в клетки. Клетки считывают вирусный ген, делают копию молекулы, называемой информационной РНК, а затем используют мРНК для сборки вирусных белков. Иммунная система обнаруживает белки и укрепляет защиту.

    Прототип ДНК-вакцины на основе белка-шипа защитил обезьян от коронавируса.

    ПРИМЕРЫ: ДНК-вакцины были одобрены для ветеринарных случаев, таких как меланома собак и вирус Западного Нила у лошадей. Не существует одобренных ДНК-вакцин для использования у людей, но исследователи проводят испытания, чтобы выяснить, могут ли они быть эффективными при таких заболеваниях, как Зика и грипп.

    КОМПАНИИ: Иновио и другие.

    РНК-вакцины

    Некоторые исследователи хотят пропустить ДНК и вместо этого доставлять информационную РНК в клетки.Клетки читают мРНК и вырабатывают спайковые белки, которые вызывают иммунный ответ.

    Биотехнологическая компания Moderna недавно завершила небольшое испытание безопасности с участием восьми добровольцев, которое показало многообещающие первые результаты против коронавируса.

    И РНК, и ДНК-вакцины можно производить быстрее, чем традиционные методы.

    ПРИМЕРЫ: Утвержденных РНК-вакцин нет, но они проходят клинические испытания против MERS и других заболеваний.

    КОМПАНИИ: Moderna, Pfizer и BioNTech, CureVac и другие.

    Вакцины вирусного вектора

    Вакцины, использующие вирус для доставки генов коронавируса в клетки.

    Вакцины с использованием аденовируса или других вирусов

    Вирусы очень хорошо проникают в клетки. С 1990-х годов исследователи изучают, как использовать их для доставки генов в клетки для иммунизации людей от болезней.

    Чтобы создать вакцину против коронавируса, несколько команд добавили ген белка шипа к вирусу, называемому аденовирусом.Аденовирус проникает в клетки и выгружает ген. Поскольку у аденовируса отсутствует один из собственных генов, он не может реплицироваться и, следовательно, безопасен.

    ПРИМЕРЫ: Некоторые вирусные векторные вакцины используются для вакцинации животных от бешенства и чумы. Johnson & Johnson разработала H.I.V. и вакцины против Эболы с использованием аденовируса. Оба препарата оказались безопасными для людей и в настоящее время проходят испытания на эффективность.

    КОМПАНИИ: Johnson & Johnson, CanSino, Оксфордский университет и другие.

    Вакцины на белковой основе

    Вакцины, в которых используется белок коронавируса или фрагмент белка.

    Вакцины с вирусоподобными частицами

    Некоторые вакцины представляют собой частицы, содержащие кусочки вирусных белков. Они не могут вызывать болезни, потому что они не настоящие вирусы, но они все же могут показать иммунной системе, как выглядят белки коронавируса.

    ПРИМЕРЫ: В эту категорию попадает вакцина против ВПЧ.

    КОМПАНИИ: Medicago, Институт Доэрти и другие.

    Рекомбинантные вакцины

    Дрожжи или другие клетки могут быть сконструированы так, чтобы нести вирусный ген и выделять вирусные белки, которые затем собираются и помещаются в вакцину.