Вторник , 21 сентября 2021
Главная / Разное / Окрашивание матрикс фото: Окрашивание волос Matrix в салоне красоты в Москве: цены, фото, отзывы

Окрашивание матрикс фото: Окрашивание волос Matrix в салоне красоты в Москве: цены, фото, отзывы

Содержание

Окрашивание волос Matrix в салоне красоты в Москве: цены, фото, отзывы

Данная торговая марка пользуется огромной популярностью в нашей стране. Она стала востребованной, благодаря своему высокому качеству и удобству в применении. С помощью данного продукта можно создавать самые шикарные, оригинальные и современные оттенки.

Длительное действие, стойкий эффект, отличный цвет, ослепительный блеск и минимальный вред структуре волос — это основные преимущества краски Matrix. Палитра цветов включает в себя самые разнообразные, модные оттенки, которые способны порадовать даже самых капризных и требовательных представительниц прекрасного пола. Краску можно использовать даже в домашних условиях. Но для наилучшего результата рекомендовано проводить окрашивание волос Matrix в салоне.

Отзывы об окрашивании Matrix помогут вам понять, что:

  • бренд предлагает широкий спектр оттенков;
  • в состав продукта не входят вредные химические добавки, которые способны нанести вред структуре волос;
  • в состав краски входят компоненты, которые обеспечивают волосам безупречный уход, питание и защиту.
  • с помощью краски процесс окрашивания осуществляется на самом высоком уровне. Результат великолепный и стойкий.
  • отлично закрашивает седину.
  • оживляет истощенные волосы.
  • в состав средства входят такие ценные компоненты, как керамиды, натуральные растительные масла жожоба, оливы, репейника.
  • краска оказывает антиоксидантное действие.
  • продукт питает, увлажняет и защищает волосы, наделяя их ослепительным блеском.

В салоне красоты Hair Lab окрашивание волос Matrix производится на высоком уровне. Наши высококвалифицированные специалисты помогут вам подобрать самый подходящий оттенок. При выборе цвета, наши стилисты учитывают цветотип клиента, его имидж и предпочтения.

На сегодняшний день самой популярной сериями данного бренда является Matrix Colour Sync. Данная краска особенно щадящая. Она идеально подходит для окрашивания очень тонких, истощенных волос. Ее основа не вредит структуре локонов, а наоборот, питает ее и делает более крепкой и выносливой. Данная серия является универсальной. В состав продукта не входит аммиак. Краска пользуется огромной популярностью среди тех, кто в первый раз решил радикально изменить свой образ или обесцветить волос.

Краска способна осветлить волосы на несколько тонов, при этом не нанести совершенно никакого вреда их структуре. Продукт великолепно закрашивает седину с первого раза. Оттенки Matrix обогащены питательными веществами, главными из которых являются керамиды.

В нашем салоне вы можете наделить свои волосы цветом, о котором давно мечтали. Мы гарантируем вам отличный и стойкий результат. Цены на окрашивание Matrix в нашем салоне доступные, поэтому создать свой индивидуальный образ может позволить себе каждая женщина.

Палитра краски Matrix (Матрикс) — фото

Матрикс краска для волос палитра

 

Продукция под брендом Matrix хорошо известна и профессионалам парикмахерского искусства, и простым пользователям. Торговая марка предлагает весь спектр средств по уходу за волосами, в том числе, и палитру безаммиачной краски для волос Матрикс.

Узнайте, в чем преимущества этих продуктов и что из предлагаемых товаров подойдет именно вам.

Секрет популярности бренда

Сегодня продукцию данного бренда можно встретить в любом салоне красоты, но мало кто знает, что палитра краски для волос Matrix разработана профессиональным парикмахером из Америки Анри Миллером в 1980 году. В разработку мастер вложил свой многолетний опыт практика, поэтому краски и продукты по уходу отвечают требованиям разных типов волос. Четко ориентированные серии поддерживают сухие и окрашенные локоны, обеспечивают достойный уход за жирными кудрями и бережно воздействуют на седые и истонченные пряди.

С 2000 года бренд является подразделением французской марки L`Oreal, что значительно укрепило позиции косметики американского происхождения в Европе.

 Отличительная особенность Matrix – использование специального самонастраивающегося пигмента. В процессе окрашивания он подстраивается под естественную пигментацию волоса, что дает гарантию 100-процентного попадания в цвет.

Другая фишка – наличие в красителях ухаживающих компонентов. Таким образом, процедура не травмирует шевелюру, а помогает сохранить природный блеск и силу локонов.

Кроме того, безаммиачная краска Матрикс палитра цветов не содержит неприятного резкого химического запаха, обеспечивая комфортные условия в процессе ее нанесения.

Уникальные краски Matrix щадят волосы

Окрашивание – это сложный химический процесс, который может негативно повлиять на структуру волосяной кутикулы, способно вызвать сухость кожи головы, ломкость прядей. Используя палитру краски Матрикс без аммиака, можно:

  • сохранить естественный блеск и мягкость кудрей;
  • добиться живого оттенка.
  • не допустить нарушения чешуйчатого слоя;
  • полностью закрасить имеющуюся седину;

В нашем каталоге представлена вся богатая профессиональная палитра красок Матрикс.

Какое направление Matrix выбрать

Для получения длительного эффекта, лучше воспользоваться красителями из ассортимента Socolor Beauty, так как они обеспечивают идеальную четкость тона. Достичь невероятного результата помогает использование передовой технологии Color Grip. В продукте для окрашивания присутствуют натуральные компоненты и уже упомянутый самонастраивающийся пигмент, который отлично взаимодействует с волосом.

Мягкий уход при тонировании обеспечат красители из серии Sync Color. Вы получите идеальный результат, нанося смесь на шевелюру, уже подвергавшуюся окрашиванию или впервые испытывающую такую процедуру. В процессе использования Sync, влага из локонов не вытягивается, сохраняется их природная эластичность, сила и блеск. Вы навсегда забудете о посеченных кончиках и сухости прядей, если выберете образцы палитры красок для волос Матрикс, представленные в нашем каталоге.

Почему стоит выбрать Sync Color

Удачно демонстрируют безаммиачную палитру цветов краски для волос Матрикс фото из нашего каталога. Представлены светлые пастельные и жемчужные тона, натуральные и медные оттенки, эффектные перламутровые и все виды шатеновых. Обеспечивается насыщенный колер и глубина цвета, а также:

  • гарантируются деликатный уход за шевелюрой;
  • без использования окислителя можно получить новый тон на натуральных и окрашенных локонах;
  • входящие в состав питательные керамиды способствуют быстрому восстановлению волосяной кутикулы, делая пряди гладкими;
  •  косы остаются мягкими и шелковистыми, легко расчесываются и укладываются.

Однако, если до этого волосы подвергались осветлению, пользоваться тонирующими составами Sync Color нежелательно.

В упаковке находится только тюбик с красителем объемом 90 мл. Для получения требуемого раствора нужно добавить крем-активатор. Все смешивают в равных пропорциях 1:1. Наносить необходимо на чистые мокрые волосы. Если окрашивание происходит впервые, полученную смесь распределяют сразу по всей длине и выдерживают 10 – 20 минут. Время процедуры зависит от структуры волоса и желаемого эффекта.

 При следующих окрашиваниях субстанцию необходимо нанести сначала на корни, выдержать половину срока и распределить по всей длине.

Как получить стойкий цвет

Для того, чтобы получить стойкий оттенок, лучше воспользоваться линейкой Matrix Socolor Beauty. Продукция подходит для всех типов шевелюры и отлично закрашивает седину. В каталоге представлены специальные товары именно для седых.

Легко найти нужную палитру цветов краски Матрикс по номерам фото в соответствующем разделе сайта.

Локоны не портятся, ведь входящие в состав натуральные ингредиенты обеспечивают глубокое проникновение в структуру волоса и гарантируют защиту кутикулы и луковицы. Керамиды заполняют поры, предупреждают выпадение и повреждение, а полимеры укрепляют изнутри.

 Покупая Соколор, учитывайте, что в упаковке есть только тюбик с красящим средством (объемом 90 мл), поэтому потребуется заказать специальный Cremes Oxydants этой же линейки. Концентрация состава:

  • 4% содержания аммиака;
  • 6% содержания аммиака;
  • 9% содержания аммиака;
  • 12% содержания аммиака.

Разводить смесь нужно, согласно прилагаемой инструкции для получения стойкого эффекта и глубокого прокрашивания по всей длине. Наносят на чистые высушенные волосы, выдерживают в течение 20 – 40 минут, затем следует тщательно промыть шевелюру и нанести кондиционер.

Matrix позволяет получить салонный результата даже в домашних условиях.

  Приобрести краситель и другие необходимые для ухода продукты в нашем магазине можно на выгодных условиях.

Окрашивание волос MATRIX — АСТЭРА

Color Sync

Серия крем-красок Color Sync предназначена для обновления оттенка, тонирования, частичного или полного окрашивания шевелюры, но не осветления. Эксперты компании предлагают также использовать средство для глазирования локонов. Это покрытие волос специальным восстанавливающим составом, наполненным керамидами. После процедуры отмечается безупречный, здоровый блеск, пряди становятся упругими и шелковистыми. Вы можете сделать как прозрачное глазирование, так и придать помимо блеска легкий оттенок. Окрашивание безаммиачным красителем Color Sync – роскошные ухоженные волосы, стойкий цвет и блеск. Идеально подходит для тонирования волос без изменения уровня тона, камуфлирования седины, придания оттенка натуральным волосам.  Краска из линейки Color Sync не содержит аммиак, что делает процедуру безопасной для локонов. Отсутствие агрессивного компонента позволяет часто использовать средство. Плюс ко всему в составе есть масса витаминов и керамиды, которые сглаживают пористость волосяного стержня, делают пряди сильными и ухоженными.

Socolor Beauty

Окрашивание волос производится с использованием красителя SOCOLOR с ухаживающим комплексом CERA-Oil и технологией стойкости цвета Color Crip. Эта услуга великолепно подходит для закрашивания седины. Вы получите стойкий цвет волос надолго. Линейка Socolor Beauty — это новый взгляд на окрашивание волос от экспертов компании Матрикс. Добиться совершенного, насыщенного суперстойкого цвета им удалось с помощью инновационной технологии ColorGrip. «Умный» краситель подстраивается под натуральный пигмент и гарантирует равномерное прокрашивание шевелюры. Среди питательных компонентов в состав крем-краски входят керамиды, экстракт жожоба, а также укрепляющий кортекс волоса полимер Hexa-Force. В комплексе они оказывают бережный уход, стимулируют быстрое восстановление структуры волоса после химического воздействия. После окрашивания и лечения волос Matrix — появляется естественный, здоровый блеск и гладкость ваших волос.

Лечение волос MATRIX Protopak 5+

Содержащийся в составе протеин способствует укреплению волос, действуя изнутри на их структуру. Пористые участки заполняются молекулами белка и полезными микроэлементами, придавая локонам идеальную гладкость. Комплекс Protopak 5+ восстанавливает гидробаланс, даря локонам мягкость и возвращая прекрасное сияние. Средство подходит для укрепления локонов перед окрашиванием или химической завивкой, а также может применяться в качестве восстанавливающего ухода для ломких и поврежденных волос. В последнем случае процедуру проводят перед окрашиванием и повторяют не ранее, чем через две недели после него. Уход применяется еженедельно или ежемесячно в зависимости от уровня ломкости волос.

КАК ПОДДЕРЖАТЬ РЕЗУЛЬТАТ

ВОССТАНОВЛЕНИЕ ОКРАШЕННЫХ И СИЛЬНО ПОВРЕЖДЕННЫХ ВОЛОС

Поврежденные в результате химического воздействия волосы требуют очень внимательного ежедневного ухода, а так же глубокого ухода в салоне, ведь окрашивание и химическая завивка могут повлиять на структуру волос на структуру волос. Формула продуктов, которую стилист использует во время оказания услуги, проникает глубоко внутрь волоса, регенерирует структуру поврежденных и пористых волос.

ГЛУБОКОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ ОКРАШЕННЫХ И СИЛЬНО ПОВРЕЖДЕННЫХ ВОЛОС

Стоимость услуги — 800 руб (10 мин)

BIOLAGE R.A.W. РЕАЛЬНО. ПОДЛИННО. ЗДОРОВО.

Этот мощный SPA-уход за волосами дает вам возможность иметь такие волосы, о которых вы всегда мечтали, и при этом всё это будет полезно для вас и для окружающей среды. Biolage R.A.W. создает приятный, красивый, здоровый и ухоженный внешний вид для ваших волос. А все потому, что в состав этой линии средств входит 70-100% натуральных ингредиентов! Уникальные запахи доставят эстетическое наслаждение, специально подобранные консистенции принесут удивительный сенсорный опыт, а подлинные профессиональные результаты после процедур — сделают вас абсолютно счастливыми! Реально. Подлинно. Здорово.

Создатели косметики считают, что ингредиенты природного происхождения, если они не подвергались излишней переработке или не были испорчены, сохраняют более 50% своей молекулярной структуры от исходного растения или минерального источника. По этой причине для создании Biolage используются только самые лучшие и качественные компоненты. А какую пользу они несут здоровью волос!

  • К примеру, кокосовое масло — эффективно проникает в волосы, и в сочетании с другими ингредиентами оно обеспечивает невероятный блеск, мягкость и силу,
  • так же как и семена подсолнечника, богатые омега-3 и 6 жирными кислотами, в сочетании с другими ингредиентами добавляют блеск и силу вашим волосам.
  • Нежная формула питательного масла семян манго и керамиды — укрепляет волосы, восстанавливая их блеск и эластичность.
  • Ягоды юкки и годжи помогают восстановить блеск чувствительным волосам, а так же убирают ощущение дискомфорта, положительно влияют  на оздоровление и восстановление волос.
  • Орхидеи помогают поддерживать глубину цвета, тон и блеск ярких окрашенных волос.
  • А маски из обогащенного витаминами лимона легко распределяются для нанесения, и дают в результате — естественный вид и мягкую подтяжку всем волосам

Совет. После процедуры окрашивания и лечения волос Matrix используйте специальные средства, предназначенные для окрашенных прядей. Они придадут натуральный блеск локонам и предупредят быстрое вымывание цвета.

Парикмахер на дом. Краска для волос Matrix Socolor Beauty

Я мечтала стать блондинкой(пишет одна особа) с однородным оттенком. Судя по прошлым эксперементам, цель достигнута не была. Я не отчаялась, пошла искать краску сама. Но опять же совершила ошибку, послушав продавца. Она посоветовала мне купить краску матрикс цвета UL-A+.

У матрикс — это значит пепельный цвет, который осветляет на 5 тонов (!). Плюсом стало то, что объем краски не маленький: 90 мл. Не стоит забывать также, что оксид добавляется в пропорции 1:2. Это значит, что оксида нужно в 2 раза больше краски. Для моих густых и средней длины волос состава хватила предостаточно. И даже немного осталось. Здесь предоставляю небольшие описания на коробке:

Собственно, как я уже говорила, в коробочке лежит краска 90 мл и инструкция. Перчаток нет.

Инструкция очень большая, на разных языках. Краска, как и другие тюбики подобного типа, закрыта стандартно. Оксид и краски перемешивала долго (относительно Эстеля). Окрашивающего состава было очень много. Оттенок стал голубоватый, приятный такой. Насторожил цвет, правда. И не зря. На фото оттенок немного искажен.

Перед окрашиванием, волосы я разделила на 2 части. И окрасила себя. Сначало корни, ну а после протянула цвет к концам, где то добавив краски. А чтобы вы ощутили всю полноту приближающийся беды, кидаю фото при другом освещении.

Напомню, что до тонирования у меня были мелированные волосы. Вы понимаете к чему я клоню? Да к тому, что после того, как я смыла краску, я заметила ужас у себя на голове. На месте мелированных прядей появились голубые прядки!

Но стоит отметить, что у корней получился очень красивый, светлый, естесственный русый оттенок 9го или 10го уровня.  По длине каких то чудес я не заметила. Рыжина в некоторых местах, из-за прошлого тонирования, остались.

Дня 2 я мыла свои волосы шампунем из серии ламинирования. Вышло получше, нежели в начале.

Но мои эксперименты не закончились… Прошло время. Поняла, что надо окрасить корни. И снова пошла за этой краской! Руки мне надо было выдернуть) Я порассуждала и решила, что не буду протягивать цвет на всю длину. Теперь я просто покрашу корни и все будет хорошо. Вот, собственно то, что было ДО:

Выдавила 30 мл краски и смешала соответствующее количество оксида. Окрасила корни, при это чуть чуть задевая прошлое окрашивание. И снова появилась синева! Да что же это такое!

Корни осветлил, а прошлое осветление осенил! Я превратилась в бабку.

В интернете я так и не нашла информацию с чем смешивать ультра блонды, чтобы не получать таких страшных результатов. Да и вообще про ультра блонды сложно что-то найти толковое в интернете. Не пойму, зачем я послушала тогда продавца и зачем я второй раз купила краску?
Надеюсь, мой опыт поможет кому-то. Краска сама по себе хорошая, но она для профессионалов)))) Только они знают куда ее добавлять. Я нет, не знаю. Спасибо за внимание) Можно сказать, что я излила свою душу.

Обращайтесь ко мне и мы вместе создадим Ваш неповторимый образ!!!
Парикмахер на дом — это современно и удобно!

палитра красок для волос Матрикс

Палитра цветов краски для волос «Матрикс» включает в себя примерно 100 оттенков. Все они идеально распределяются на прядках, долго держатся и не вредят структуре локонов. Имеется несколько ключевых линий краски для легкого тонирования и основного окрашивания.

Известные линейки краски Матрикс для окрашивания волос

  • Color Sync. Краска Матрикс, палитра которой предназначена для обновления тона, подойдет и для полного окрашивания волос, но не для осветления. Производители предлагают также применить такое средство для глазирования волос. После этой процедуры можно отметить появление безупречного, здорового блеска, шелковистости и упругости на прядях.
  • Color Sync Extra Coverage. Здоровье прядок, щадящее и безопасное окрашивание — это то, на что акцентирует внимание данная серия красок Матрикс. В составе этих средств нет аммиака. Матрикс краска, палитра которой представлена этой линейкой, в себе содержит инновационный комплекс Cera-Oil. Его компоненты добавят волосам гладкости, будут глубоко питать и укреплять волосяной стержень. Помимо этого, они создадут базу для равномерной прокраски волос.
  • Socolor Beauty. Линия Socolor Beauty — это новый взгляд на покраску волос от производителей Матрикс. Достичь совершенного, насыщенного и суперстойкого оттенка удастся за счет инновационной технологии ColorGrip. «Умный» краситель подстраивается под натуральный пигмент и гарантирует равномерное окрашивание прядок. Среди питательных составляющих данной крем-краски отмечают экстракт жожоба, керамиды, а также укрепляющий полимер Hexa-Force. Совместно все эти компоненты оказывают бережный уход, стимулируя быстрое восстановление структуры локона после химического влияния. После того, как произошло окрашивание этой краской на волосах появляется здоровый, естественный блеск и гладкость шевелюры.
  • Ultra Blonde. Уникальную и эффективную крем-краску, которая позволит за одно окрашивание достичь осветления на 2–3 тона, предоставляет эта палитра Матрикс. Краска для волос такого типа минимально травмирует структур волос.
  • Matrix Light Master. В линейке этой краски присутствует обесцвечивающая пудра Light Master. Такое средство позволит гарантированно осветлить волосы до 8 уровня всего за единое окрашивание. В пользу пудры стоило бы отметить и богатый на пантенол состав краски. Данный компонент ускорит достижение нужного эффекта и одновременно позаботиться о состоянии локонов. После осветления может применяться и краска для тонирования от компании Матрикс.

Как разобраться в обозначениях цветовой палитры красок Матрикс?

Матрикс – краска для волос, палитра которой включает в себя больше 50 оттеночных цветов. Основные из них сгруппировались в трех коллекциях: специальной (speciality), смешанной (blended)и блестящей (reflect). При обозначении цветов палитра использует арабские цифры, которые свидетельствуют о насыщенности тона. При этом латинские буквы указывают на сам цвет.

Ориентируясь в данных обозначениях, можно с легкостью выбрать тон для себя и степень его оттенка. Опытные колористы, выбирая между разными составами, получают не только глубоко индивидуальные оттенки для окрашивания конкретных волос, но и создают дополнительные эффекты ореола, свечения или плавного стекания тона от корней волос к их концам при использовании этой краски. Палитра Матрикс многогранна, и это прекрасно.

Выбор оттенка состава Матрикс с учетом особенностей внешности

  1. Девушкам с кожей, склонной к покраснениям, и с ярким румянцем палитра краски Матрикс не советует выбирать яркие тона для окрашивания волос. Так огненно-рыжие или красноватые цвета стоит оставить в стороне. Таким дамам можно обратить внимание на более натуральные, светло-каштановые или русые тона, которые зрительно смягчают розовые щеки.
  2. В процессе выбора цвета для волос стоит не забывать о том, что яркие цвета подчеркивают все неровности, имеющиеся на коже, а поэтому насыщенные оттенки стоит оставить женщинам с ровным тоном кожи.
  3. В зависимости от цветовых предпочтений для покраски волос женщина должна учитывать и то, что цветовая гамма может поменять размер зон на теле: темные — уменьшают, сужают и скрадывают, а светлые — увеличивают, расширяют и выпячивают. В связи с этим при помощи оттенка локонов можно скорректировать и форму лица. Таким образом, круглолицым дамам стоит присмотреться к темным оттенкам для окрашивания, которые могут вытянуть и сузить овал лица.
  4. Темные тона на волосах прибавляют женщине возраста, а светлые цвета – забирают их.
  5. Палитра красок Матрикс для волос закрасит седину, если будут использоваться натуральные оттенки.
  6. Не стоит идти на кардинальную смену первоначального тона волос, в особенности за одно окрашивание. Оптимальный вариант при этом – изменение волос на пару тонов.
Мне нравитсяНе нравится

Matrix краска для волос цвета-палитра цветов,фото на волосах

Matrix краска для волос цвета. Краска Matrix производит компания L’OREAL. Марка Matrix появилась в Москве в 2003 г. и объединяет в себе более 400 наименований косметической продукции. Среди них средства для укладки волос, химической завивки, ухода за волосами и др. Теперь средства Matrix широко применяется в парикмахерских многих городов России.

Matrix не только окрасит ваши волосы в яркие цвета, но и придаст им здоровый блеск. Для колориста настоящей находкой стала краска из этой серии — SOCOLOR.beauty. Она позволяет добиться практически любого цвета. Matrix -краска для волос, которая содержит специальный комплекс по уходу за вашими волосами. Во время окрашивания волосы получают дополнительное питание и защиту от окрашивающих веществ. Если ваши волосы до окрашивания были ослабленными, то кроме нового цвета, краска для волос Matrix подарит им блеск и силу.

Уникальные цвета краски для волос Matrix

Для ещё более безопасного окрашивания создана краска Color Sync. Она не содержит аммиака и используется для поддержания цвета. Краской для волос Matrix марки Color Sync можно часто пользоваться, она не только помогает дольше сохранять приобретенный цвет, но и сохраняет насыщенность естественного цвета волос.

Благодаря своему составу вся краска Matrix восстанавливает и разглаживает волосы. В ней содержится Hexa-Force – полимер, который способен восстанавливать структуру волос изнутри, а керамиды выравнивают внешнюю поверхность. В результате краска ровно ложится, а поверхность окрашенных волос начинает отражать свет. Кроме того краска Matrix содержит масло жожоба, которое образует пленку, защищающую от агрессивного воздействия внешней среды, и добавляет волосам блеска.

 

Насыщенные цвета краски для волос Matrix

Ваши волосы долго будут сохранять цвет, краска для волос Matrix смывается только после 20 применений шампуня. А то, что эта краска обладает фруктовым ароматом, делает процесс окраски не только творческим, но и приятным занятием. В результате окрашивания ваши волосы не только приобретают новый насыщенный цвет, краска для волос Matrix превращает окрашивание в приятное и полезное для здоровья волос времяпрепровождение. А эстетическое удовольствие от смены имиджа поднимет настроение и повысит самооценку.

Matrix краска для волос отзывы

 

Любой опыт, хороший он или плохой — все равно опыт, который может пригодиться в дальнейшем. Иногда, перед тем, как окрасить волосы новой краской, нам хотелось бы узнать отзывы других женщин, ранее использовавших эту краску. Продавцы-консультанты, как правило, не беспристрастно рекламируют каждую краску для волос, ведь их основная цель – продать товар. Многие женщины испробовали на своем опыте краску для волос Matrix. Давайте спросим у них: понравилась ли им эта краска.

Matrix краска для волос, отзыв Елены:

Если говорить правду и только правду, то от этой краски я, безусловно, ожидала большего. Так уж ее рекламировал… А на самом деле – ничего особенного. Мне нравится, когда после покраски волосы становятся блестящими, а после Matrix я этого как-то не заметила. Более того, от обычной сторублевой краски эффект был даже лучше. Между прочим, краска для волос Matrix далеко и не такая стойкая, как говорят ее производители. И запах у нее резкий, что отталкивает от нее некоторых клиенток. Короче, мне не сильно понравилась эта краска.

Отзыв Ольги о Matrix-краске для волос

Не буду скрывать, мне краска очень понравилась. Я раньше использовала краску Wella, так после нее через два месяца применения мои волосы буквально превращались в паклю, становились безжизненными, тусклыми ломкими, жесткими. Краска Matrix меня приятно удивила. Уже прошло 3 месяца, а я не замечаю никаких отрицательных изменений в состоянии моих волос. Они все такие же блестящие, шелковистые, красивые, здоровые. И мой парикмахер очень удачно подобрал оттенок краски, когда начали отрастать корни. Я практически не заметила разницы между окрашенными волосами и моими собственными. Всем рекомендую, не пожалеете!

Matrix краска для волос, отзыв Аллы

Как по мне, так краска хорошая. Я сама – парикмахер, с данной краской работаю около трех лет. Мне кажется, что у данной краски оптимальное соотношение между качеством и ценой. Для своих клиенток я обычно использую краску, которая не содержит аммиак, так называемую без аммиачную. Пока жалоб в адрес краски со стороны моих клиенток не поступало. После окрашивания волосы приобретают блеск, но одновременно остаются эластичными, живыми. Результат можно продлить, если использовать профессиональные средства по уходу за волосами

Отзыв Екатерины о краске для волос Matrix

Я довольна краской Matrix. Скажу больше: когда впервые ее попробовала, была вообще в восторге. Конечно, ранее я использовала обыкновенные краски, так вот они сильно портили мои волосы через некоторое время. Зато после краски Matrix волосы стали блестящими, гладкими, послушными. Красота! Иногда мне кажется, что краска не то, что не вредит волосам, а наоборот их восстанавливает! Может быть это потому, что Матрикс – без аммиачная краска. Да, она для меня немного дорогая, но ведь и волосы у меня недешевые. Лучше заплатить дороже, зато волосам она не вредит.

Matrix краска для волос, отзывы – Татьяна

Хорошая краска. Даже интересно, что туда добавляет производитель, что волосы приобретают такой здоровый вид. А оттенки-то какие шикарные. Просто мечта. Единственное, что мне в ней не нравится, так это то, что она быстро смывается.

Инструкиця к краскам для волос Matrix

палитра и отзывы (Матрикс Колор Синк)

Многие наслышаны о косметических средствах Matrix. Сейчас их можно увидеть на страницах журналов и в Интернете. Многие женщины пользуются косметикой именно этой фирмы. Самые известные из них – Натали Портман, Сара Джессика Паркер, Пенелопа Круус и многие другие.

Кто же основал эту популярную торговую марку? Это был парикмахер Арнольд Миллер. Он отказался от успешной карьеры и решил создать собственную линию профессиональной косметики для волос. Кому, как ни парикмахеру знать, что понравится представительницам прекрасного пола. Вскоре к Арнольду присоединились единомышленники, и получилась профессиональная и дружная команда.

Фирма появилась в 1980-м году в штате Огайо. Через несколько лет косметика фирмы Matrix стала популярной в Америке. Настоящего успеха компания добилась в 2000 году. В это время компания Matrix вошла в гигантский косметический концерн L’OREAL. Благодаря слиянию косметика фирмы Матрикс стала известной за рубежом. Создавались новые формулы, не имеющие аналогов. Грамотная рекламная компания привела к тому, что косметика стала известной во всем мире. В 2003-м году косметика Matrix появилась в нашей стране.

Matrix Color Sync — это краска без аммиака которая придает волосам новый оттенок. Ее используют для восстановления оттенка стойких красителей. Специальная формула и восстанавливающий комплекс выравнивают пористые участки волос и облегчают впитывание краски. Безаммиачная формула не вредит волосам и является совершенно безвредной.

Крем-краска Matrix Color Sync позволяет тонировать волосы без оседания красителя на отдельных прядях. После окрашивания волосы становятся шелковистыми и блестящими. Керамиды, входящие в состав краски выравнивают волосы и делают их гладкими. Помимо этого окрашивание этой краской воспринимается как глазирование.

Глазирование – покрытие волос слоем глазури, содержащей керамиды, которая придает волосам блеск. Глазирование может быть цвет или бесцветным. Глазурь позволяет оттенять волосы на один-два тона в темную или светлую сторону. За счет пленки, которая создается при глазировании, волосы утолщаются, что увеличивает их объем.

Палитра цветов Matrix Color Sync

Sheer pastel:

SPV — пастельный перламутровый
SPA — пастельный пепельный
SPN — пастельный нейтральный
SPM — пастельный мокка

Жемчужные:

8P светлый блондин жемчужный
10P очень-очень светлый блондин жемчужный

Мокка:

5М светлый шатен мокка
6М темный блондин мокка
7М блондин мокка
8М светлый блондин мокка
10М очень-очень светлый блондин мокка

Мокка золотистый:

6MG темный блондин мокка Золотистый
8MG светлый блондин мокка Золотистый

Мокка Мокка:

5MМ светлый шатен мокка мокка
7MМ блондин мокка мокка
9MМ очень светлый блондин мокка мокка
10MМ очень-очень светлый блондин мокка

Коричнево-красный:

4BR шатен коричнево-красный
6BR темный блондин коричнево-красный

Коричнево-медный:

4BC шатен коричнево-медный
6BC темный блондин коричнево-медный
8BC светлый блондин коричнево-медный

Перламутровый:

8V светлый блондин перламутровый
10V очень-очень светлый блондин перламутровый

Пепельный:

1A иссиня-черный пепельный
4A шатен пепельный
6A темный блондин пепельный
8A светлый блондин пепельный
10A очень-очень светлый блондин пепельный

Натуральный:

3N темный шатен
5N светлый шатен
6N темный блондин
8N светлый блондин
10N очень-очень светлый блондин

Теплый натуральный:

3WN темный шатен теплый натуральный
5WN светлый шатен теплый натуральный
6WN темный блондин теплый натуральный
8WN светлый блондин теплый натуральный
10WN очень-очень светлый блондин теплый натуральный

Золотистый:

4G шатен золотистый
8G светлый блондин золотистый
10G очень-очень светлый блондин золотистый

Медно-золотистый:

6CG темный блондин медно-золотистый
8CG светлый блондин медно-золотистый
10CG очень-очень светлый блондин медно-золотистый

Красно-медный:

6RC темный блондин красно-медный
8RC светлый блондин красно-медный

Прозрачные оттенки:

Прозрачный оттенок Clear

НОВИНКА! Коллекция окрашивания METALLIC TOPAZ:

7С блондин медный
9С очень светлый блондин медный

Фото: до и после окрашивания

На фото: девушка до и после окрашивания оттенком 7м (темный блонд мокка).

Применение краски

Применение: первый этап — смешивание в равных частях краски и крема-активатора Color Sync. Время выдержки на волосах составляет 10-20 минут и определяется исходя из используемой техники.

При первичном нанесении смесь необходимо наносить на корни и сразу же распределять по всей длине. При вторичном окрашивании Color Sync наносится на прикорневую часть, выдерживается половину времени, после чего распределяется по всем волосам. Тонирование требует выдержки в течение 20 минут без дополнительного теплового воздействия.

В случае же глубокого тонирования седых волос голову следует укрыть шапочкой и также выдержать 20 минут без тепла.

Применение прозрачного оттенка Color Sync: смешать с активатором в пропорции 1:1 (42 мл:42 мл), нанести на волосы. Возможно применение продукта для «разбавления» слишком темного цвета. В таком случае прозрачный оттенок добавляется к любой краске Color Sync.

Отзывы о краске Matrix Color Sync

Надежда пишет: Мне очень понравилась краска этой фирмы Она равномерно смывается, не портит волосы и придает волосам приятный естественный оттенок. Во время окрашивания не воняет, как другие краски. Легко наносится и не портит волосы.

Отзыв Валентины: Уже несколько лет я крашусь в блонд краской matrix 11А+6 % оксид. В парикмахерской мне посоветовали покрасить волосы безаммиачной краской Матрикс Колор Синк. Решила попробовать. После окрашивания цвет волос стал однотонным, волосы блестящими и здоровыми. Рекомендую попробовать.

Оксана пишет: Привет девчонки! Крашусь уже больше года стойкими красками. Результат такой: сухие, пожженные и секущие волосы. Пользуюсь различными масками и бальзамами для волос. А вообще хочу отрастить свои здоровые волосы, а покрашенные состричь. Недавно решила покрасить волосы в тон натуральному цвету. Мой выбор пал на безаммиачную краску Матрикс Колор Синк. После окрашивания волосы стали лучше выглядеть и приняли однотонный цвет. Краска очень понравилась.

Отзыв Евгении: Всем приветик! Хочу рассказать вам о краске Матрикс Колор Синк. Сразу скажу, что красилась в салоне красоты. Итак, в последний раз красилась в темный оттенок «Шоколад». Сейчас захотела покрасить волосы в тон натурального. Мой натуральный цвет волос пепельно-русый 7-8 уровня. Сначала мне делали смывку (думала, что испорчу волосы, но, слава богу, все обошлось). В общем, после смывки и глазирования у меня получился цвет «мокко» 8-го уровня с рыжим оттенком. Через неделю ходила в салон для добавления пепельно-русого оттенка. Мастер смешала оттенки 7.1 и 8.0 и 6% окислитель. После смывания результат был потрясающим. Волосы гладкие, блестящие и мягкие на ощупь.

PhaseStain: цифровое окрашивание изображений количественной фазовой микроскопии без меток с использованием глубокого обучения

Подготовка образцов и визуализация

Все образцы, которые использовались в этом исследовании, были получены из основной лаборатории трансляционной патологии (TPCL) и подготовлены отделом гистологии Лаборатория в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. Они были получены после деидентификации информации о пациенте и подготовлены на основе существующих образцов. Таким образом, эта работа не противоречила стандартной практике ухода или процедур сбора образцов.

После заливки в парафин, фиксирующего формалин, тканевый блок делится с помощью микротома на срезы толщиной ~ 2–4 мкм. Этот шаг необходим только на этапе обучения, когда преобразование фазового изображения в изображение светлого поля должно быть изучено статистически. Затем эти тканевые срезы депарафинизируют с использованием ксилола и помещают на стандартное предметное стекло с использованием Cytoseal TM (Thermo-Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) с последующим запечатыванием образца покровным стеклом.В процессе обучения / обучения этот этап запечатывания дает несколько преимуществ: защита образца во время визуализации и обработки образцов и уменьшение артефактов, таких как колебания толщины образца.

После подготовки образца изображение образца было визуализировано с помощью встроенного в чип голографического микроскопа для получения количественного фазового изображения (подробное описание приведено в следующем подразделе). После процесса QPI предметные стекла без этикеток помещали в ксилол на ~ 48 ч, пока покровное стекло не могло быть удалено без искажения ткани.После удаления покровного стекла его несколько раз окунули в абсолютный спирт и 95% спирт, а затем промыли в D.I. вода в течение ~ 1 мин. После этого этапа тканевые слайды окрашивали H&E (кожная ткань), красителем Джонса (ткань почек) и трихромом Массона (ткань печени), а затем закрывали покровные стекла. Затем эти образцы ткани были визуализированы с помощью автоматического слайд-сканирующего микроскопа светлого поля (Aperio AT, Leica Biosystems) с объективом 20 × / 0,75NA (Plan Apo), оснащенного адаптером увеличения 2 ×, что дает эффективный размер пикселя ~ 0.25 мкм.

Количественная фазовая визуализация

Установка безлинзовой визуализации

Количественные фазовые изображения образцов ткани без этикеток были получены с использованием установки для голографии без линз 41 . В качестве источника освещения использовался источник света (WhiteLase Micro, NKT Photonics, Дания) с центральной длиной волны 550 нм и спектральной шириной полосы ~ 2,5 нм. Неколлимированный свет, излучаемый одномодовым волокном, использовался для создания квазиплоской волны, освещающей образец.Образец помещался между источником света и чипом датчика изображения CMOS (IMX 081, Sony Corp., Минато, Токио, Япония, размер пикселя 1,12 мкм) с расстоянием от источника до образца ( z 1 ). 5–10 см и расстояние от образца до датчика ( z 2 ) 1–2 мм. Этот голографический микроскоп без линз на кристалле имеет субмикронное разрешение с эффективным размером пикселя 0,37 мкм, охватывая образец FOV ~ 20 мм 2 (что составляет всю активную область датчика).Ступень позиционирования (MAX606, Thorlabs Inc., Ньютон, штат Нью-Джерси, США), на которой находился датчик CMOS, позволила выполнить трехмерное преобразование микросхемы имидж-сканера для выполнения пиксельного сверхвысокого разрешения (PSR) 5,41,42 и multiheight- на основе итеративного восстановления фазы 41,43 . Все оборудование для обработки изображений автоматически контролировалось LabVIEW (National Instruments Corp., Остин, Техас, США).

Метод пиксельного сверхвысокого разрешения (PSR)

Для синтеза голограммы высокого разрешения (с размером пикселя ~ 0.37 мкм), используя только канал G1 шаблона Байера (R, G1, G2 и B), был применен алгоритм PSR на основе сдвига и сложения 42,44 . Этап трансляции, на котором находится датчик изображения, был запрограммирован на сдвиг в поперечном направлении на сетке 6 × 6 с интервалом между субпикселями на каждом расстоянии от образца до датчика. Голограмма с низким разрешением была записана в каждой позиции, и поперечные смещения были точно оценены с использованием алгоритма оценки смещения 41 . Результатом этого шага является шесть неперекрывающихся панелей, каждая из которых была дополнена до размера 4096 × 4096 пикселей и индивидуально восстановлена ​​по фазе, что подробно описано ниже.

Многовысотное восстановление фазы

Были сняты поточные голограммы без линз на восьми расстояниях от образца до сенсора. Размер шага осевого сканирования был выбран равным 15 мкм. Точные шаги z были получены путем применения алгоритма голографической автофокусировки на основе критерия разреженности краев («Тамура градиента», то есть ToG) 45 . Нулевая фаза была назначена измерению интенсивности объекта в качестве начального предположения фазы для начала итераций. Затем использовался итерационный алгоритм восстановления фазы с несколькими высотами , 46, путем распространения комплексного поля вперед и назад между каждой высотой с использованием передаточной функции свободного пространства 47 .Во время этого итеративного процесса фаза оставалась неизменной в каждой осевой плоскости, а амплитуда обновлялась с использованием квадратного корня из измерения интенсивности объекта. Одна итерация была определена как распространение голограммы с восьмой высоты (наиболее удаленной от сенсорного чипа) до первой высоты (ближайшей к датчику) с последующим обратным распространением комплексного поля до восьмой высоты. Обычно фаза восстанавливается после 10–30 итераций. На заключительном этапе реконструкции комплексная волна, определяемая сведенными амплитудой и фазой в данной плоскости голограммы, распространялась на плоскость объекта 47 , из которой была извлечена фазовая составляющая образца.

Предварительная обработка данных и регистрация изображений

Важным шагом в нашем процессе обучения является выполнение точной регистрации изображения между двумя модальностями визуализации (QPI и светлое поле), что включает в себя этапы как глобального сопоставления, так и локального выравнивания. Поскольку сеть нацелена на изучение преобразования от изображения, полученного без меток, полученного по фазе, в изображение с гистологически окрашенным светлым полем, крайне важно точно выровнять FOV для каждой пары входного и целевого изображений в наборе данных.Мы выполняем эту процедуру согласования кросс-модальности в четыре этапа; шаги 1, 2 и 4 выполняются в MATLAB (The MathWorks Inc., Натик, Массачусетс, США), а шаг 3 включает TensorFlow.

Первый шаг — найти примерно совпадающий FOV между QPI и соответствующим изображением светлого поля. Это делается путем первого бикубического понижения дискретизации всего изображения слайда (WSI) (~ 60 на 60 тыс. Пикселей), чтобы соответствовать размеру пикселя изображения, полученного по фазе. Затем каждое фазовое изображение размером 4096 × 4096 пикселей было обрезано на 256 пикселей с каждой стороны (в результате получилось изображение с размером 3584 × 3584 пикселей), чтобы удалить заполнение, которое используется для процесса восстановления изображения.После этого этапа как светлое поле, так и соответствующие фазовые изображения извлекаются по краям с использованием метода Кэнни 48, , который использует двойной порог для обнаружения сильных и слабых краев на градиенте изображения. Затем вычисляется матрица оценок корреляции путем корреляции каждого фрагмента размером 3584 × 3584 пикселей результирующего краевого изображения с тем же размером, что и изображение, извлеченное из краевого изображения светлого поля. Изображение с наивысшим показателем корреляции указывает на совпадение между двумя изображениями, и соответствующее изображение светлого поля вырезается из WSI.После этой процедуры первоначального согласования количественное фазовое изображение и изображения, полученные с помощью светлопольного микроскопа, грубо согласовываются.

Второй этап используется для корректировки возможных поворотов между этими грубо согласованными парами изображений, которые могут быть вызваны небольшим несоответствием в размещении образца во время двух экспериментов по получению изображений (которые выполняются на разных системах формирования изображений, голографических или светлых полях). ). Этот шаг регистрации на основе интенсивности коррелирует пространственные шаблоны между двумя изображениями; фазовое изображение, которое преобразовано в формат целого числа без знака, и компонент яркости изображения светлого поля использовались для этой мультимодальной структуры регистрации, реализованной в MATLAB.Результатом этой цифровой процедуры является матрица аффинного преобразования, которая применяется к фрагменту изображения светлопольного микроскопа, чтобы сопоставить его с количественным фазовым изображением того же образца. После этого шага регистрации фазовое изображение и соответствующее изображение светлого поля глобально совмещаются. Дополнительная обрезка по 64 пикселя с каждой стороны для выровненных пар изображений используется для корректировки возможного угла поворота.

Третий этап включает обучение отдельной нейронной сети, которая примерно обучается преобразованию количественных фазовых изображений в окрашенные изображения светлого поля, что может помочь в коррекции искажений между двумя модальностями изображения на четвертом / последнем этапе.Другими словами, чтобы сделать локальную регистрацию управляемой, мы сначала обучаем глубокую сеть с глобально зарегистрированными изображениями, чтобы уменьшить энтропию между изображениями, полученными с помощью двух методов визуализации (то есть QPI по сравнению с изображением окрашенной ткани в светлом поле). Эта нейронная сеть имеет ту же структуру, что и сеть, которая использовалась для окончательного процесса обучения (см. Следующий подраздел об архитектуре GAN и ее обучении) с входными и целевыми изображениями, полученными на втором этапе регистрации, который обсуждался ранее.Поскольку пары изображений еще недостаточно хорошо выровнены, обучение останавливается на раннем этапе только на ~ 2000 итерациях, чтобы избежать структурных изменений на выходе, которые должны быть изучены сетью. Выходные и целевые изображения сети затем используются в качестве пар регистрации на четвертом этапе, который представляет собой алгоритм регистрации эластичного изображения, используемый для корректировки регистрации локальных признаков 16 .

Архитектура и обучение GAN

Архитектура GAN, которую мы использовали для PhaseStain, подробно описана на рис.6 и дополнительная таблица 1. После регистрации количественных фазовых изображений без меток с изображениями светлого поля гистологически окрашенных срезов ткани эти точно выровненные поля зрения были разделены на перекрывающиеся участки размером 256 × 256 пикселей, которые затем были используется для обучения модели GAN. 2 $$

(3)

где D (.) и G (.) относятся к операторам дискриминатора и генератора, соответственно, x вход обозначает вход генератора, который представляет собой количественное фазовое изображение без меток, а z метка обозначает светлопольное изображение гистологически окрашенной ткани. Сеть генератора G пытается сгенерировать выходное изображение с теми же статистическими характеристиками, что и метка z , в то время как дискриминатор, D , пытается различить целевое изображение и выходное изображение генератора.Идеальный результат (или состояние равновесия) будет, когда выходные изображения генератора и целевые изображения имеют одинаковое статистическое распределение, где в этом случае D ( G ( x входной )) должно сходиться к 0,5. Для глубокой сети генератора мы определили функцию потерь как:

$$ \ ell _ {{\ mathrm {generator}}} = L_1 \ left \ {{z _ {{\ mathrm {label}}}, G \ left ({x _ {{\ mathrm {input}}}} \ right)} \ right \} + \ lambda \\ \ times {\ mathrm {TV}} \ left \ {{G \ left ({x _ {{\ mathrm {input}}}} \ right)} \ right \} + \ alpha \ times \ left ({1 — D \ left ({G \ left ({x _ {{\ mathrm {input}}}} \ right)} \ right)} \ right) ^ 2 $$

(4)

, где L 1 {.} термин относится к абсолютной попиксельной разнице между выходным изображением генератора и его целевым изображением, TV {.} означает регуляризацию общей вариации, которая применяется к выходному сигналу генератора, а последний член отражает штраф, связанный с к предсказанию дискриминаторной сети выхода генератора. Параметры регуляризации ( λ , α ) были установлены на 0,02 и 2000, так что общий член потерь вариации, λ × TV { G ( x вход )}, составлял ~ 2 % от потери L 1 и члена потери дискриминатора α × (1 — D ( G ( x вход ))) 2 составлял ~ 98% от общие потери генератора, л, , генератор , .

Фиг.6

Архитектура сетей генератора и дискриминатора в рамках GAN

Для генерации глубокой нейронной сети мы адаптировали архитектуру U-net 49 , которая состоит из тракта понижающей и повышающей дискретизации, причем каждый путь содержит четыре блока, образующих четыре различных уровня (см. Рис. 6 и дополнительную таблицу 1). . В тракте понижающей дискретизации каждый остаточный блок состоит из трех сверточных слоев и трех блоков линейного выпрямления с утечкой (LReLU), используемых в качестве функции активации, которая определяется как:

$$ {\ mathrm {LReLU}} (x) = \ left \ {{\ begin {array} {* {20} {c}} x & {{\ mathrm {for}} \; x> 0} \\ {0.1x} & {{\ mathrm {else}}} \ end {array}} \ right. $$

(5)

На выходе каждого блока количество каналов увеличивается в 2 раза (за исключением первого блока, который увеличивается с 1 входного канала до 64 каналов). Блоки соединены слоем объединения средних значений шага два, который понижает дискретизацию выходного сигнала предыдущего блока в два раза как для горизонтального, так и для вертикального измерения (как показано на рисунке 6 и в дополнительной таблице 1).

В канале повышающей дискретизации каждый блок также состоит из трех сверточных слоев и трех функций активации LReLU, которые уменьшают количество каналов на его выходе в четыре раза. Блоки соединены билинейным слоем повышающей дискретизации, который увеличивает размер выходных данных предыдущего блока в два раза для обоих боковых измерений. Функция конкатенации с соответствующей картой характеристик из тракта понижающей дискретизации того же уровня используется для увеличения количества каналов на выходе предыдущего блока на два.Два пути соединены на первом уровне сети сверточным слоем, который поддерживает количество карт характеристик из выходных данных последнего остаточного блока в пути понижающей дискретизации (см. Рисунок 6 и дополнительную таблицу 1). Последний слой представляет собой сверточный слой, который отображает выходные данные пути повышающей дискретизации в 3 канала цветовой карты YCbCr.

Дискриминаторная сеть состоит из одного сверточного слоя, пяти блоков дискриминатора, слоя среднего пула и двух полностью связанных слоев.Первый сверточный слой получает 3 канала (цветовую карту YCbCr) либо от выхода генератора, либо от цели и увеличивает количество каналов до 64. Блоки дискриминатора состоят из двух сверточных слоев, причем первый слой поддерживает размер карты признаков, а количество каналов, а второй слой увеличивает количество каналов в два раза и уменьшает размер карты функций в четыре раза. Слой среднего пула имеет размер фильтра 8 × 8, что приводит к матрице с размером ( B , 2048), где B относится к размеру пакета.Выходные данные этого слоя с объединением средних значений затем передаются в два полностью связанных слоя, причем первый слой сохраняет размер карты признаков, а второй уровень уменьшает выходной канал до 1, в результате чего выходной размер составляет ( B , 1). Выход этого полностью связанного слоя проходит через сигмовидную функцию, указывающую на вероятность того, что вход трехканального дискриминатора взят из гистологически окрашенного изображения светлого поля. Для дискриминаторной сети все сверточные слои и полносвязные слои связаны функциями нелинейной активации LReLU.

На протяжении всего обучения размер фильтра свертки был установлен равным 3 × 3. Для генерации фрагментов мы применили увеличение данных, используя перекрытие фрагментов 50% для изображений ткани печени и кожи и 25% перекрытия фрагментов для ткани почек. изображения (см. Таблицу 1). Обучаемые параметры, включая фильтры, веса и смещения в сверточных слоях и полностью связанных слоях, обновляются с помощью оптимизатора адаптивной оценки момента (Adam) со скоростью обучения 1 × 10 — 4 для сети генератора и 1 × 10. −5 для дискриминаторной сети.

Таблица 1 Детали обучения виртуальному окрашиванию различных типов тканей с помощью PhaseStain. После обучения слепой вывод занимает ~ 0,617 с для поля зрения ~ 0,45 мм 2 , что соответствует ~ 3,22 мегапикселя (см. Раздел «Обсуждение»)

Для каждой итерации дискриминатора было v итераций генераторная сеть; для тренировки ткани печени и кожи v = max (5, этаж (7 — w /2)), где мы увеличивали w на 1 на каждые 500 итераций ( w было инициализировано как 0).Для тренировки почечной ткани мы использовали v = max (4, этаж (6 — w /2)), где мы увеличивали w на 1 на каждые 400 итераций. Это помогло нам научить дискриминатор не подгонять под целевые изображения светлого поля. Мы использовали партии размером десять для тренировки срезов ткани печени и кожи и пять для срезов ткани почек. Все записи сверточного ядра инициализируются с использованием усеченного нормального распределения. Все члены смещения сети инициализируются равными нулю.Обучение сети остановилось, когда потери набора проверки L 1 не уменьшились после 4000 итераций. Типичный график сходимости нашей тренировки показан на рис. 7.

Рис. 7: Графики сходимости PhaseStain для набора проверки цифрового окрашивания H&E кожной ткани .

a L 1-потеря по количеству итераций. b Потери генератора, l генератор в зависимости от количества итераций

Детали реализации

Количество фрагментов изображения, которые использовались для обучения, количество эпох и расписания обучения показаны в таблице 1 .Сеть была реализована с использованием Python версии 3.5.0 и фреймворка TensorFlow версии 1.7.0. Мы реализовали программное обеспечение на настольном компьютере с процессором Core i7-7700K @ 4,2 ГГц (Intel Corp., Санта-Клара, Калифорния, США) и 64 ГБ ОЗУ, работающим под управлением операционной системы Windows 10 (Microsoft Corp., Редмонд, Вашингтон, США). СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). После обучения для каждого среза ткани соответствующая сеть была протестирована с 4 фрагментами изображения размером 1792 × 1792 пикселей с перекрытием ~ 7%. Затем выходные данные сети были сшиты, чтобы сформировать окончательное выходное изображение сети размером 3456 × 3456 пикселей (FOV ~ 1.7 мм 2 ), как показано, например, на рис. 2. Обучение и тестирование сети проводились с использованием двух графических процессоров GeForce GTX 1080Ti (NVidia Corp., Санта-Клара, Калифорния, США).

Новый метод сегментации ткани на гистопатологических изображениях целых слайдов с высоким разрешением, окрашенных гистопатологическими препаратами

Основные моменты

Первый подход к сегментации тканей в изображениях целых слайдов с высоким разрешением (WSI) окрашенных образцов кожи с гематоксилин-эозином (H&E).

Наш метод точно сегментирует пустые пространства в тканевых структурах (средний индекс Жаккара 0,751 для области, охватываемой тканью, и 0,916 для всего изображения).

Наш алгоритм вычислительно эффективен, он работает, по крайней мере, с той же скоростью, что и существующие методы сегментации тканей, и его можно легко ускорить в 4 раза за счет небольшого снижения производительности.

Abstract

Сегментация тканей на полных изображениях слайдов является важной задачей цифровой патологии, необходимой для эффективной и точной компьютерной диагностики.Точная сегментация тканей особенно важна для постановки правильного диагноза в тех случаях, когда структура ткани образца очень пористая, например, образцы кожи. В этой статье мы рассмотрели проблему передней и фоновой сегментации в гистопатологических изображениях образцов кожи, окрашенных гематоксилином и эозином (H&E), которая еще не решена, с помощью нового метода, основанного на сочетании статистического анализа и определения порога цвета. , и бинарная морфология. Мы проверили наш алгоритм на больших отрывках из 60 полных изображений слайдов с высоким разрешением, с разным качеством окрашивания и снятых в различных условиях визуализации из трех лабораторий.Размер отрывков варьируется от 2000 × 1500 до 20000 × 30000 пикселей, а количество изображений, используемых в нашем исследовании, совпадает с количеством изображений H&E, используемых другими исследовательскими группами. Мы сравнили наш метод с опубликованными (GrabCut и FESI) и показали, что наш подход превосходит свои аналоги (индекс Жаккара 0,929 против 0,776 и 0,695).

Ключевые слова

Гистопатология

Анализ изображений

сегментация ткани

гематоксилин-эозин

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2019 Авторы.Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Введение в окрашивание H&E: протокол, передовой опыт, шаги и многое другое: Leica Biosystems

Для рутинной диагностики использование гематоксилина и эозина (H&E) далеко предпочтительнее для просмотра патологами деталей клеточной и тканевой структуры. Изменение интенсивности пятен часто определяется опытом патологоанатома и личными предпочтениями. Поскольку это окрашивание демонстрирует такой широкий спектр функций цитоплазматического, ядерного и внеклеточного матрикса, почти во всех учебных текстах используются изображения H&E.Сегодня мы продолжаем использовать это простое и незаменимое краситель, которое оставалось неизменным уже более века.

Получайте обновления Knowledge Pathway прямо на ваш почтовый ящик.

Подписка

Если вы просматривали этот образовательный веб-семинар, тренинг или учебное пособие по программе Knowledge Pathway и хотели бы подать заявку на получение кредитов на продолжение обучения в вашей сертифицирующей организации, загрузите форму, чтобы помочь вам добавить в свой транскрипт образовательные кредиты, о которых вы сообщаете сами.

Подать заявку на самооценку образовательных кредитов
Рис. 1: Skin H&E.Обратите внимание на сбалансированную окраску этого участка кожи. Ядра окрашены в фиолетовый цвет, а компоненты цитоплазмы — в розовый.

Процедура окрашивания для H&E следует базовому протоколу:

  • Депарафинизация
  • Обезвоживание
  • Гематоксилин
  • Дифференциация
  • Воронение
  • Эозин
  • Обезвоживание
  • Очистка
9 легко воспроизводится реагенты достаточно эластичны, чтобы обеспечить постоянное окрашивание большого количества слайдов перед заменой реагентов.

Рис. 2: Двоеточие H&E. Обратите внимание на сбалансированную окраску в этой части толстой кишки. Микроворсинки на столбчатом эпителии очень четкие.
Фотография предоставлена: Стэнли Хансен

В прошлом пятна и их компоненты обычно изготавливались в лаборатории. Готовые реагенты, имеющиеся в продаже, были необычными и дорогими. Таким образом, в качестве экономичного способа выполнения H&E специалисты научились делать красители по мере необходимости.Задача заключалась в том, чтобы убедиться, что качество пятна остается неизменным. Разные техники следуют рецептам, используя свой индивидуальный подход, поэтому изготовление красителей обычно оставалось на одного человека. При этом в лаборатории было больше технических специалистов, поэтому время, необходимое для подготовки реагентов, не уменьшало общую рабочую нагрузку команды.

Рис. 3: Плацента H&E. Красные кровяные тельца в этом срезе плаценты представляют собой яркую окраску, которую можно испытать с помощью этого простого красителя.

Многие лаборатории считают, что заказ красителей является самым простым способом обеспечить стабильное и воспроизводимое качество. Большое разнообразие комбинаций красителей гематоксилином и эозином дает возможность настроить желаемые результаты с очень небольшими хлопотами. По мере того, как все больше технических специалистов выходят на пенсию и компании становятся более экономичными, сокращение штата делает использование коммерчески доступных реагентов идеальным, потому что технические специалисты могут лучше сосредоточиться на встраивании и нарезке, которые являются областями лаборатории, которые предлагают наименьшую степень автоматизации.

Рис. 4. Клубочки (красная стрелка) и канальцы (синяя стрелка), отображаемые с помощью H&E. Ядра окрашены в фиолетовый цвет, а компоненты цитоплазмы — в розовый.

Для новых профессионалов в области гистологии времена создания реагентов быстро уходят в прошлое. Я считаю, что этот сдвиг может быть проблематичным, прежде всего потому, что часть искусства, характерного для гистологии, утеряна. Одна из моих личных проблем при работе со студентами — помочь им устранить аномалии окрашивания.Когда пятна производятся в лаборатории, команда на собственном опыте узнает, что происходит, когда компонент отсутствует или неправильно добавлен в смесь. Эти изменения могут привести к незначительным изменениям окрашенных слайдов, которые, как ожидается, в конечном итоге исправит команда гистологов. В конечном счете, новые гистологические группы могут столкнуться с трудностями при поиске и устранении незначительных изменений, которые можно легко исправить, не имея опыта создания реагентов и уроков, извлеченных в этом процессе.

Что в пятне H&E?

Окрашивание гематоксилином и эозином

используется во многих областях гистологической лаборатории, включая замороженные срезы, тонкоигольные аспираты и залитые парафином ткани.Чтобы лучше понять, что делает слайд хорошо окрашенным, важно понимать компоненты пятна.

Гематоксилин используется для иллюстрации ядерных элементов в клетках. Глубина окраски зависит не только от количества ДНК в ядрах, но и от продолжительности времени, в течение которого образец находится в гематоксилине.

Гематоксилин — довольно простой в изготовлении краситель. Сам краситель добывается из дерева Haematoxylum campechianum. Окисление гематоксилина производит гематеин, который на самом деле является красителем, используемым для окрашивания H&E.Добавление протравы улучшает способность гематеина прикрепляться к анионным (отрицательно заряженным) компонентам тканей.

Рис. 5: На этом изображении крупноклеточной анапластической медубластомы гематоксилин играет ключевую роль в диагностике. Обратите внимание на митотические цифры, указывающие на быстрорастущую опухоль. В клетках также отмечается нерегулярность ядра и слипание хроматина. Фото: Frontalcortex.com

Гематоксилины обычно классифицируются по протраве, используемой перед окрашиванием.Протравы усиливают положительный ионный заряд гематина. Это способствует связыванию гематина с анионным тканевым компонентом, которым чаще всего является хроматин. Тип протравы также влияет на окончательный цвет окрашенных компонентов. Наиболее распространенная протрава, используемая в рутинной гистологии, — это сульфат алюминия-аммония (квасцы). Эта протрава заставляет ядра окрашиваться в красный цвет, который затем меняется на более знакомый синий цвет, когда образец позже промывают слабощелочным раствором.

Гематоксилин Майера — это гематоксилин квасцов, широко используемый краситель, который можно использовать как для прогрессивных, так и для регрессивных красителей.Его часто используют как ядерный контраст для специальных красителей и иммуногистохимии. Для этих целей Майер используется для окрашивания ядер, а затем их воронения без использования дифференциатора. Майер — краситель на водной основе.

Гематоксилин Харриса — еще один широко используемый гематоксилин квасцов, который может использоваться для прогрессивного окрашивания цитологических образцов, но также может использоваться для прогрессивного или регрессивного окрашивания в гистологии. Окрашивание дает четкие детали ядра.Одна из проблем при использовании Harris заключается в том, что его лучше всего дифференцировать с мягкой кислотой, в отличие от более часто используемых дифференциаторов на основе соляной кислоты. Харрис — это пятно на спиртовой основе. Гематоксилин Гилла представляет собой гематоксилин квасцов. Его можно использовать в качестве прогрессирующего или регрессивного красителя, и он доступен в различных концентрациях. Поскольку в его состав входят вода и этиленгликоль, самоокисление пятна обычно предотвращается в течение нескольких месяцев, что делает его более стабильным, чем гематоксилин Харриса. Однако природа жабр такова, что может происходить внеядерное окрашивание.Муцин и даже клей, используемый на предметном стекле, могут сильно загрязниться жабрами.

Гематоксилины, которые используют соли железа в качестве протравы, обычно используются в специальных красителях. Это потому, что они могут демонстрировать больше тканевых структур, чем гематоксилины квасцов, такие как миелиновые и эластиновые волокна. Один из самых известных — это пятно Вейгерта, которое используется для окрашивания Верхоффа-Ван Гизона, показанного на изображении.

Рис. 6. Обратите внимание на эластиновые волокна в аорте, окрашенные с помощью Verhoeff-Van Gieson, также известного как эластичное окрашивание.Изменения в этих волокнах указывают на патологические процессы, которые иначе невозможно обнаружить. Фото: Стэнли Хансен

Рассмотрев ядерные пятна, давайте поговорим о красителях цитоплазматических компонентов. Эозин — наиболее часто используемый контрастный краситель, который различает цитоплазму и ядра клеток. Обычно он розовый, с разными оттенками розового для разных типов волокон соединительной ткани.

Эозин Y — это наиболее часто используемая форма эозина, которую можно использовать как в воде, так и в спирте.Добавление небольшого количества уксусной кислоты также обострит окраску эозина. Эозин с добавлением флоксина усиливает красный цвет, наблюдаемый при окрашивании H&E. Так что для тех, кто хочет видеть более насыщенные красные, можно добавить флоксин.

Рис. 7: Ядра на этом изображении имеют хороший контраст с цитоплазмой и эритроцитами (RBC) внутри кровеносного сосуда. Обратите внимание на интенсивность эритроцитов по сравнению с розовым цветом цитоплазмы окружающих клеток.

Многие лаборатории считают, что заказ красителей является самым простым способом обеспечить стабильное и воспроизводимое качество.Большое разнообразие комбинаций красителей гематоксилином и эозином дает возможность настроить желаемые результаты с очень небольшими хлопотами. По мере того, как все больше технических специалистов выходят на пенсию и компании становятся более экономичными, сокращение штата делает использование коммерчески доступных реагентов идеальным, потому что технические специалисты могут лучше сосредоточиться на встраивании и нарезке, которые являются областями лаборатории, которые предлагают наименьшую степень автоматизации.

Иногда используются другие смеси эозина, такие как EA50 и EA65. Эти красители в основном используются для цитологии и, помимо эозина Y, включают светло-зеленые, желтоватые и коричневые цвета Бисмарка.Добавление этих двух красителей обеспечивает изменение цвета цитоплазмы от бледно-голубого до розового, что лучше всего проявляется в плоскоклеточных клетках мазка Папаниколау. Концентрация смеси определяет обозначение 50 или 65.

Рис. 8: На этом изображении мазка Папаниколау пациента с плоскоклеточным раком можно оценить красоту разнообразной окраски цитоплазмы. Красная стрелка указывает на злокачественное ядро ​​с очень маленькой цитоплазмой. Черная стрелка показывает нормализованную клетку острого воспаления, по размеру аналогичную эритроцитам на предыдущем изображении.Обратите внимание, насколько крупнее злокачественная клетка по сравнению с нормальными ядрами на предыдущем изображении.

Дифференциация пятен дает возможность выборочно удалять пятна с тканей по вкусу зрителя. В случае гематоксилина чаще всего используются соляная кислота (для быстрой дифференцировки) и уксусная кислота (для более медленной и контролируемой дифференцировки). Хотя соляная кислота (HCl) исторически была стандартом, более мягкие кислоты используются для более щадящего удаления красителя.Частично эта тенденция связана с использованием автоматического окрашивания, которое должно учитывать движение роботизированной руки в дополнение к времени, проведенному в реагенте.

Реагенты для синения, такие как «Водопроводная вода Скотта», используются для изменения цвета гематоксилина с красного на ожидаемый традиционный синий цвет. Эти слегка щелочные растворы химически изменяют краситель, вызывая это изменение цвета. В некоторых местах водопроводная вода содержит достаточно минералов, так что pH делает воду достаточно щелочной, чтобы допускать посинение ядер без необходимости использования специального реагента для посинения.Однако в большинстве случаев лаборатории обычно добавляют этот шаг, чтобы обеспечить надлежащее воронение.

В сочетании эти компоненты составляют стандартную окраску, наиболее используемую в гистологической лаборатории.

Выбор протокола окрашивания H&E

Следующим шагом к получению хорошего окрашивания является определение желаемого типа окрашивания H&E. Обычно существует три типа окрашивания H&E: прогрессивное, модифицированное прогрессивное и регрессивное.

Прогрессирующее окрашивание происходит, когда гематоксилин добавляется к ткани без последующего применения дифференциатора для удаления избытка красителя.Поскольку этап дифференциации отсутствует, может происходить фоновое окрашивание, особенно заряженных или обработанных слайдов. Патологи иногда предпочитают этот тип окрашивания, потому что неклеточный материал, такой как муцин, окрашивается гематоксилином. Это внеклеточное окрашивание может быть индикатором хорошо дифференцированных опухолей.

Рис. 9: В этом отделе толстой кишки муцин все еще виден с бокаловидными клетками.

Следующая таблица содержит протокол с простым регрессивным окрашиванием, которое обеспечивает хороший баланс ядерных и цитоплазматических пятен.Этот протокол разработан с учетом слабого кислотного дифференциатора.

После того, как компоненты окрашивания выбраны, можно приступить к базовому протоколу. Оттуда отредактируйте либо гематоксилин с шагом 30 секунд, либо эозин с шагом 15 секунд. Помните, что эозин проникает намного быстрее. Если нет необходимости значительно осветлить или затемнить интенсивность окрашивания эозином, лучше всего подойдут более короткие интервалы. Также важно менять только одно пятно за раз.Может показаться, что гематоксилин перекрашивается, когда эозина просто нужно богаче.

Поскольку лаборатории продолжают расти, потребность в стабильных результатах и ​​непрерывной пропускной способности становится все более актуальной. Воспроизводимость — важная часть качества лабораторных пятен. При ручном окрашивании, человеческие факторы могут привести к тому, что каждая окрашенная подставка для слайдов будет отличаться от предыдущей. Добавление автоматизации не только устраняет возможность несогласованности, но и освобождает технологов для выполнения других задач в лаборатории.

Важно, чтобы был достигнут правильный баланс красителей. Перекрашивание гематоксилином может создать иллюзию неокрашенного эозина, так же как перекрашивание эозином может сделать гематоксилин светлее, чем он есть на самом деле. Поэтому при оптимизации окраски убедитесь, что вы редактируете время только одного из компонентов. Этот прием избавит вас от необходимости тратить дополнительное время на корректировку пятна.

Ксилол 2 минуты
Ксилол 2 минуты
100% этанол 2 минуты
100% этанол 2 минуты
95% этанол 2 минуты
Водяная стирка 2 минуты
Гематоксилин 3 минуты
Водяная стирка 1 минута
Дифференциатор (слабокислый) 1 минута
Водяная стирка 1 минута
Воронение 1 минута
Водяная стирка 1 минута
95% этанол 1 минута
Эозин 45 секунд
95% этанол 1 минута
100% этанол 1 минута
100% этанол 1 минута
Ксилол 2 минуты
Ксилол 2 минуты
покровное стекло
Рис.10: На этом изображении ядра в этом образце толстой кишки, кажется, подавляют другие клеточные компоненты. Даже красные кровяные тельца приглушены. Меньшее время в гематоксилине ИЛИ дополнительное время в эозине может обеспечить лучший баланс.
Рис. 11: Ядра в этом отделе почки теряются в розовом цвете эозина. Дополнительное время, проведенное в гематоксилине, сделало бы эти ядра более заметными.

При регрессивном и модифицированном прогрессивном окрашивании используется дифференциатор.Если дифференциатор производится собственными силами, есть вероятность, что он будет либо слишком слабым, либо слишком сильным. Оба сценария повлияют на окрашивание. Если дифференциатор сильнее, чем предполагалось, он удалит больше гематоксилина и сделает ядра бледными. Время тоже важно. Слишком много времени в правильно приготовленном дифференциаторе также приведет к удалению большего количества гематоксилина и, в конечном итоге, ослабит окраску ядер.

Умеренная кислотность имеет решающее значение для срока хранения гематоксилина. Без него щелочность ополаскивателя водопроводной водой повысит pH, так что озеро красителя может выпасть в осадок, а цвет изменится с вишнево-красного на пурпурно-красный.Периодическое добавление небольшого количества уксусной кислоты к гематоксилину поможет поддерживать соответствующий pH и может продлить срок службы пятна.

Вода используется как дифференциатор эозина. Обычно после стадии эозина используют 95% этанол. Этанол помогает ополаскивать предметное стекло, а вода вытягивает излишки эозина из тканей. Этот шаг может помочь контролировать окраску, но увеличение времени позволяет получить более светлые пятна, а сокращение времени позволяет сохранить более яркое окрашивание.Однако избыток воды в ксилоле может продолжить процесс дифференциации, и его можно увидеть после нанесения покровного стекла в виде розовой дымки на предметном стекле.

Не все ткани созданы одинаково. Кисты и образцы жировой ткани, даже при правильной обработке, могут быть очень плохо различимы после окрашивания предметного стекла. Эти образцы часто имеют открытые пространства, где жидкость или жир находились в ячейке, а тонкость клеточных стенок может создавать впечатление светлых, когда окраска является просто артефактом тканевого типа.

Высококлеточные образцы (например, миндалины, лимфатические узлы) могут быть очень опасными. Помните, что у лимфоцитов мало цитоплазмы, и между клетками почти нет клеточного материала, как в других тканях. По этой причине гематоксилин не должен конкурировать с эозином. Компактная природа клеток также концентрирует ДНК, придавая этим высококлеточным тканям вид перекрашенных, хотя на самом деле их, возможно, просто нужно разрезать на более тонкие срезы.

Фиг.12: Лимфатический узел
Рис. 13: Почка — обратите внимание на различия между этим участком лимфатического узла и почкой, оба сечения сечением 4 мкм. Эти образцы, окрашенные по одному и тому же протоколу, сильно различаются по внешнему виду из-за клеточности.

Использование чистых и свежих реагентов для депарафинизации необходимо для удаления парафина с предметного стекла перед добавлением красителей. В то время как ксилол является наиболее часто используемым растворителем, его заменители становятся все более популярными, поскольку они считаются менее опасными и более экологичными.Вода в растворителях, вызванная загрязнением реагента или окружающей средой с высокой влажностью, снижает способность растворителя удалять парафин. Оставшийся парафин препятствует проникновению красителей в ткани, что придает им неровный вид.

Самый простой способ предотвратить это — чаще менять реагенты. Добавление небольшого количества гранул осушителя (около столовой ложки на емкость с реагентом) также снизит загрязнение воды растворителями. Эти меры особенно важны при использовании заменителя ксилола, поскольку эти реагенты, как правило, гораздо менее устойчивы к любому загрязнению водой, чем ксилол.

Пошаговое руководство по нанесению окрашивания H&E

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) является наиболее широко используемым красителем в лабораториях гистологии и гистопатологии. При правильном выполнении он может демонстрировать широкий спектр нормальных и аномальных клеточных и тканевых компонентов, и, тем не менее, это относительно простое окрашивание для парафиновых или замороженных срезов. В гистопатологии большая часть случаев может быть диагностирована опытным патологом с использованием только окрашивания H&E.

Небольшое количество слайдов можно эффективно окрашивать вручную, в то время как в лабораториях с высокой производительностью окрашивание можно проводить успешно и последовательно с помощью автоматических окрашивателей слайдов.

Существует ряд широко используемых составов гематоксилина и эозина, каждый из которых имеет различные преимущества и недостатки. Некоторые лаборатории предпочитают готовить собственные растворы, в то время как другие выбирают готовые к использованию коммерческие продукты.

Окраска H&E дает полное представление о микроанатомии органов и тканей.Гематоксилин точно окрашивает ядерные компоненты, включая гетерохроматин и ядрышки, в то время как эозин окрашивает цитоплазматические компоненты, включая коллаген и эластические волокна, мышечные волокна и эритроциты. В высококачественном окрашивании H&E наблюдаются тонкие различия в оттенках цвета, создаваемых пятнами, особенно эозином, и это помогает в обнаружении и интерпретации морфологических изменений, связанных с заболеванием.

Важно, чтобы люди, выполняющие и оценивающие окрашивание H&E на качество, знали о тонкостях окрашивания, знали, чего можно достичь при правильном окрашивании с использованием высококачественных реагентов, и знали, что искать под микроскопом.Поддержание стабильных высококачественных окрашиваний H&E является фундаментальным требованием в лабораториях гистопатологии.

В следующих разделах описаны основные этапы окрашивания H&E.

Удалить воск

После подготовки парафиновой секции все элементы пропитываются парафиновым воском, который является гидрофобным и непроницаемым для водных реагентов, и окружается им. Большинство клеточных и тканевых компонентов не имеют естественного цвета и не видны.Первым шагом в нанесении окрашивания H&E является растворение всего парафина с помощью ксилола (углеводородного растворителя).

Гидратация секции

После тщательной депарафинизации предметное стекло пропускают через несколько смен спирта для удаления ксилола, затем тщательно промывают водой. Срез теперь гидратирован, так что водные реагенты легко проникают в клетки и тканевые элементы.

Нанесите ядерный краситель гематоксилин

Теперь предметное стекло окрашено ядерным красителем, таким как гематоксилин Харриса, который состоит из красителя (окисленный гематоксилин или гематеин) и протравы или связующего вещества (соль алюминия) в растворе.Первоначально это окрашивает ядра и некоторые другие элементы в красновато-пурпурный цвет.

Завершите «Ядерное пятно» с помощью «Посинения»

После ополаскивания в водопроводной воде срез «вороняют» обработкой слабощелочным раствором. На этом этапе гематоксилин приобретает темно-синий цвет. Теперь срез можно промыть и проверить, правильно ли окрашены ядра, показать адекватный контраст и оценить уровень фонового окрашивания.

Удалить излишки фоновых пятен (дифференцировать)

В большинстве случаев, когда используется гематоксилин Харриса, требуется этап дифференциации (обесцвечивания) для удаления неспецифического фонового окрашивания и улучшения контрастности.Используется слабокислый спирт. После такой обработки снова требуется посинение и тщательное полоскание. Методы окрашивания, которые включают этап обесцвечивания или дифференциации, называются «регрессивными» окрашиваниями.

Нанесите контрастное пятно Eosin Counterstain

Срез теперь окрашивают водным или спиртовым раствором эозина (в зависимости от личных предпочтений). Это окрашивает многие неядерные элементы в разные оттенки розового.

Промыть, обезвожить, очистить и закрепить (нанести покровное стекло)

После окрашивания эозином предметное стекло пропускают через несколько смен спирта для удаления всех следов воды, затем промывают в нескольких ваннах с ксилолом, который «очищает» ткань и делает ее полностью прозрачной.Наносится тонкий слой полистирола, а затем покровное стекло. Если окрашивание и все последующие этапы были выполнены правильно, на слайде будут обнаружены все важные микроскопические компоненты, и он будет стабильным в течение многих лет.

Поиск и устранение неисправностей H&E Stains

Хотя окрашивание H&E является относительно простым окрашиванием, существует множество артефактов, которые могут помешать хорошему окрашиванию.

Артефактов можно объяснить множеством причин.

Поиск и устранение неисправностей H&E Stains

Подготовка образцов тканей для гистологического исследования от пациента до патологоанатома требует осторожности, навыков и тщательных процедур. В этом руководстве представлены практические советы по передовым методам и простые способы избежать распространенных ошибок.

В этом разделе выделены советы по регулярному окрашиванию и получению покровных стекол. Мы надеемся, что каждый шаг станет ценным напоминанием о хорошей гистологической практике и поможет в устранении неполадок, когда все же возникают неприемлемые результаты.

Хотите увидеть все 101 шаг к лучшей гистологии?

Загрузите 101 шаг к лучшей гистологии прямо сейчас!

Каждый шаг в протоколе окрашивания точно рассчитан по времени.

Время этапа окрашивания приблизительное, «если мы торопимся», некоторые этапы пропускаются. Это может привести к противоречивым результатам.

Эти срезы были вырезаны из одного блока одинаковой толщины и вручную окрашены H&E разными сотрудниками с использованием того же метода.Даже макроскопически можно увидеть несостоятельность пятна.

Контрольные слайды регулярно окрашивают для контроля качества окраски.

Контрольные слайды никогда не используются для пятен H&E. Это может затруднить определение того, вызвана ли проблема окрашивания плохими реагентами, несоответствующим протоколом или плохой фиксацией.

Этот отдел почки включает множество эозинофильных тканевых элементов и хорошо сохранившихся ядер, что позволяет надежно оценить качество окрашивания H&E.Плацента — это еще один тип образцов, который можно использовать в качестве полезного средства контроля.

Время перемешивания, стирки и слива оптимизировано для всех этапов окрашивания.

Время перемешивания, стирки и слива несовместимо. Растворители и реагенты быстро загрязняются. Окрашивание становится непостоянным.

Одним из преимуществ использования автоматического прибора для окрашивания является то, что время перемешивания, стирки и слива одинаковое. Если правильно контролировать другие переменные, это обеспечит хорошие и стабильные результаты.

Оптимизирована депарафинизация слайдов.

Депарафинизация предметных стекол иногда бывает неполной, и на предметных стеклах присутствуют пятна остаточного воска. В результате на срезах образуются неокрашенные или неравномерно окрашенные участки.

На этом срезе, окрашенном H&E, видна большая неокрашенная область слева и несколько более мелких участков, которые либо частично окрашены, либо неокрашены. Это связано с неполным удалением воска перед окрашиванием.

Растворители и окрашивающие реагенты регулярно меняются в зависимости от количества окрашенных слайдов или обработанных стоек.

Замена растворителей и окрашивающих реагентов происходит бессистемно. Их не заменяют, пока качество пятна не ухудшится.

В этом разделе показано некачественное мутное окрашивание гематоксилином. Этот реагент следует немедленно заменить.

Слайды тщательно гидратированы перед окрашиванием гематоксилином.

Раствор гематоксилина быстро загрязняется спиртом, а иногда и ксилолом. Это вызывает неравномерное окрашивание.

Неравномерное окрашивание гематоксилином, видимое в эпидермисе на этом участке кожи, было вызвано остаточным ксилолом (и следами воска), присутствующим при нанесении гематоксилина.

Тщательно контролируется эффективность растворов гематоксилина. В течение срока службы растворы гематоксилина постепенно разбавляются переносом с предметных стекол и штативов, а также подвержены продолжающемуся окислению.

Окрашивание гематоксилином

меняется изо дня в день, и мы не пытаемся понять, почему.Например, площадь поверхности окрашивающей ванны, степень аэрации во время окрашивания и температура окружающей среды могут влиять на скорость окисления.

Показаны два слайда из одного блока управления. Их окрашивали H&E с использованием идентичных протоколов на автоматическом окрашивателе, но с интервалом в семь дней между запусками. Даже макроскопически различия в уровне окрашивания очевидны.

Тщательное «посинение» ядер щелочным заменителем водопроводной воды Скотта или аммиачной водой всегда проводится после окрашивания гематоксилином.На это требование влияет естественный pH водопроводной воды.

Иногда ядра выглядят розоватыми на завершенных срезах из-за неполного «посинения» в щелочной водопроводной воде после окрашивания гематоксилином. Ядра, неокрашенные гематоксилином (или сверхдифференцированные) и перекрашенные эозином, также выглядят розовыми.

A. На этом участке ядра эпидермиса плохо выражены и имеют розоватый цвет. Этот участок не был должным образом «воронен» в щелочной воде после окрашивания гематоксилином (кожа, H&E).
B. Это показывает другой участок, который был должным образом «воронен» после ядерного окрашивания. Здесь ядра выражены гораздо лучше (кожа, H&E).

«Посинение» сопровождается очень тщательной промывкой в ​​водопроводной воде для удаления остаточной щелочи, которая может препятствовать окрашиванию эозина и вызывать слабое и неравномерное окрашивание.

Неэффективная стирка после «посинения» (оставления остаточной щелочи) вызывает слабое и неравномерное окрашивание эозином.

В этом разделе показано влияние остаточной щелочи на окрашивание эозином.Обратите внимание на пятнистый характер пятна (селезенка, H&E).

Контролируется pH раствора эозина. Его pH поддерживается близким к 5,0 для поддержания оптимального окрашивания. Добавление пары капель уксусной кислоты может использоваться как удобное средство снижения pH.

Не предпринимается никаких попыток контролировать pH эозина. Когда интенсивность окрашивания спадает, раствор заменяют (вынос щелочной водопроводной воды может вызвать повышение pH растворов эозина).

Срез легкого, окрашенного H&E. Окрашивание эозином всегда очень слабое и совершенно неприемлемое. Обратите внимание, что единственными компонентами, окрашенными эозином, являются эритроциты.

Срезы тщательно обезвоживаются перед помещением в ксилол для очистки.

Срезы иногда быстро пропускают через спирт в ксилол. Очистка в ксилоле, загрязненном водой, может привести к появлению крошечных капелек воды в ткани, которые под микроскопом будут видны как непрозрачные участки с недостаточной детализацией.

Этому разделу не хватает ясности (невооруженному глазу он кажется непрозрачным). При внимательном осмотре обнаруживаются крошечные капельки воды, присутствующие по всему периметру.

Покровное стекло всегда наносится до того, как секция успеет высохнуть и будет использована высококачественная среда. Необходимо знать о свойствах среды при длительном хранении, поскольку кристаллы могут появиться в среде низкого качества, иногда через длительный период (месяцы или годы).

Срезы могут частично высохнуть перед нанесением покровного стекла, в результате чего некоторые ядра станут черными.Mountant, выбранный только на основании цены, может образовывать кристаллы во время длительного хранения, и покровные стекла могут подниматься.

A. Этому участку дали возможность частично высохнуть перед закрытием покровного стекла. Это привело к тому, что крошечные пузырьки воздуха застряли над некоторыми ядрами, что сделало их черными (иногда это называется «кукурузными хлопьями»).
B. Покровный срез, окрашенный H&E, демонстрирующий множество преломляющих сферокристаллов, которые образовались из некачественной среды в течение шести месяцев после монтажа.

Содержимое Leica Biosystems Knowledge Pathway регулируется условиями использования веб-сайта Leica Biosystems, доступными по адресу: Legal Notice. Контент, включая вебинары, обучающие презентации и сопутствующие материалы, предназначен для предоставления общей информации по конкретным темам, представляющим интерес для специалистов здравоохранения, и не предназначен и не должен рассматриваться как медицинский, нормативный или юридический совет. Взгляды и мнения, выраженные в любом стороннем контенте, отражают личные взгляды и мнения докладчиков / авторов и не обязательно представляют или отражают взгляды или мнения Leica Biosystems, ее сотрудников или агентов.Любые ссылки, содержащиеся в контенте, обеспечивающем доступ к сторонним ресурсам или контенту, предоставляются только для удобства.

Для использования любого продукта следует обращаться к соответствующей документации продукта, включая информационные руководства, вкладыши и руководства по эксплуатации. Leica Biosystems и редакторы настоящим отказываются от любой ответственности, возникающей прямо или косвенно в связи с использованием материалов, в том числе из-за любых лекарств, устройств, методов или процедур, описанных в материалах.

Copyright © 2021 Leica Biosystems, подразделение Leica Microsystems, Inc. и ее дочерних компаний Leica Biosystems. Все права защищены. LEICA и логотип Leica являются зарегистрированными товарными знаками Leica Microsystems IR GmbH.

Микрофотография — фильтры для черно-белой микрофотографии

При черно-белой фотографии через микроскоп фильтры используются в первую очередь для управления контрастом в конечном изображении, захваченном на пленке. Образцы, которые сильно отличаются по цветным элементам от биологических пятен, переводятся в оттенки серого на черно-белой пленке и часто будут иметь одинаковую яркость.В этом случае важные детали образца могут быть потеряны из-за отсутствия контраста. Методы фильтрации для черно-белой пленки значительно отличаются от тех, которые используются в цветной микрофотографии.

Для лучшего изображения образцов с помощью черно-белой микрофотографии обычно используются фильтры для выборочного поглощения одного или нескольких цветов, особенно при использовании панхроматических пленок, которые имеют одинаковую чувствительность к более чем одному цвету пятна. Многие окрашенные биологические образцы демонстрируют очень бледные цвета на ярком фоне (при использовании микроскопии в проходящем свете в светлом поле), которые будут выглядеть как светло-серые тона на белом фоне при записи на черно-белую пленку.Для увеличения контраста к световому тракту микроскопа добавляется цветной фильтр, который поглощает окрашенный цвет образца, делая его более темным серым. Контрастность можно регулировать таким образом, выборочно выбирая фильтры, поглощающие различное количество цвета пятна. Эта концепция исследуется с помощью микрофотографий, представленных на рисунке 1, которые иллюстрируют тонкий срез Solanum tuberosum (картофель), окрашенный четырехкратной смесью красителей, содержащей сафранин О (окрашивает ядра, хромосомы, одревесневшие и кутинизированные клеточные стенки в красный цвет), Fast Green (окрашивает цитоплазму и стенки клеток целлюлозы в зеленый цвет), Crystal Violet (окрашивает зерна крахмала в фиолетовый) и Orange G (окрашивает ацидофильную цитоплазму и стенки клеток от желтого до зеленого).

Микрофотография, показанная на Рисунке 1 (а), была сделана с использованием светопольного освещения и фильтров нейтральной плотности с использованием цветной прозрачной (реверсивной) пленки Fujichrome 64T. На этом изображении показаны зерна крахмала в матриксе клубней, окрашенные преимущественно сафранином O и кристаллическим фиолетовым, в то время как оставшаяся часть образца состоит из целлюлозы и клеточных стенок, окрашенных в зеленый цвет Fast Green и Orange G. На рисунке 1 (b) показано то же поле, сфотографированное с использованием Kodak T-Max 100 (сплошная панхроматическая черно-белая негативная пленка), но с красным фильтром Kodak Wratten номер 25 (см. Таблицу 2), вставленным в световой тракт микроскопа.Красные области образца уменьшаются контрастом с помощью фильтра, который также вносит слишком большой контраст в детали образца, окрашенные в синий и зеленый цвета.

Синий фильтр Kodak номер 47B был помещен в световой тракт микроскопа для записи микрофотографии, показанной на рисунке 1 (c). С этим фильтром зерна крахмала приобрели повышенный контраст, но зеленые области образца теряют как контрастность, так и детализацию. На рис. 1 (d) показан образец, когда фильтр Kodak номер 58 (зеленый) помещен в световой тракт.Этот зеленый фильтр увеличивает контраст зерен крахмала по сравнению с рисунком 1 (b), но снижает контраст в областях, окрашенных зелеными красителями. Общий контраст оптимизирован с помощью микрофотографии, представленной на рисунке 1 (d).

Как правило, при использовании цветных фильтров в черно-белой микрофотографии используйте фильтры, которые дополняют цвет пятна образца (они поглощают большую часть преобладающих длин волн, передаваемых пятном), чтобы максимизировать контраст в конечных изображениях.Для достижения среднего уровня контрастности используйте фильтры, которые лишь частично поглощают цвета, отображаемые интересующими элементами. Наконец, чтобы уменьшить контраст до минимума, используйте фильтры, цвета которых идентичны цветам образца. Комбинация фильтров может использоваться для увеличения контрастности деталей на образцах, окрашенных более чем одним цветом.

Характеристики абсорбции биологических пятен
Пятно Видимый свет
Диапазон поглощения
Кислота Фуксин
Синий Анивый -620 Azure B 580+ Azure C 580-640 Basic Fuchs Блестящий крезиловый синий 550+ Кармин 500-570 Конго красный 9029 550-610 Дарр ow Красный 450-550 Eosin Y 490-530 Эритрозин B Erythrosin Erythrosin 530-550 Быстрый зеленый 560+ Giemsa 500+ Светлый Светлый Luxol Fast Blue 500-640 Метиловый зеленый 560+ Метиленовый синий 5 красный 480-570 Нигросин 450+ 90 292 Nuclear Fast Red 460-550 оранжевый G 450-510

Флоксин B

510-560 Прусский синий 560+ Пиронин B
9029 9029 9029 Saab -480
Сафранин О 470-550 Судан IV 470-580 Судан красный Тартазин 400-460 Толуидиновый синий 9015 3 560+ Трипановый синий 500+ Wright’s 500+ 9015 составление гистограмм , представляющих спектры поглощения обычных биологических пятен.

Большинство биологических образцов не обладают достаточным цветом и контрастом, чтобы их можно было легко отобразить в оптическом микроскопе с использованием освещения светлым полем. Эти образцы обычно не поглощают видимый свет в какой-либо значительной степени (они не являются хорошими образцами с амплитудой ) и могут быть замечены как грубый контур с некоторыми внутренними деталями только при уменьшении размера апертуры конденсатора, часто до точки введения оптического артефакты. Чтобы обойти эту проблему, микроскописты часто обрабатывают биологические клетки и ткани реактивными органическими красителями, которые выборочно окрашивают и окрашивают различные части биологической архитектуры.Поскольку в светлопольной микроскопии фон часто кажется белым или очень светло-серым, окрашенная ткань будет казаться цветной и наложенной на светлый фон. Этого часто бывает достаточно, чтобы представить интересующие детали видимыми и с достаточным контрастом, чтобы получить хорошие микрофотографии.

Во многих случаях два или более пятен разного цвета объединяются, чтобы помочь различить клеточные элементы, расположенные близко друг к другу, создавая цветовой контраст, который отделяет один элемент от другого.Например, ядра клеток можно окрашивать гематоксилином, природным лейкосоединением, извлеченным из колотых бревен, которое избирательно связывается с хроматином. Для обеспечения контраста гематоксилин часто сочетают с эозином, красным флуоресцеиновым красителем, окрашивающим различные цитоплазматические структуры. Комбинация этих двух красителей делает клетки с ядрами, окрашенными в темно-синий цвет, и имеющие цитоплазматические компоненты, окрашенные в красный цвет.

Процедуры окрашивания биологических тканей варьируются от очень простых смесей отдельных клеток с красителем до сложных многоступенчатых процессов срезов тканей, которые требуют значительного количества времени и материалов.Мазки часто можно окрасить, просто добавив смесь красителя и фиксатора в культуральную пробирку, содержащую исследуемые клетки. Срезы тканей сложнее и требуют нескольких этапов фиксации и срезов, прежде чем их поместить на предметные стекла микроскопа и пропустить через весь спектр красителей и промывочных растворов.

Большинство красителей представляют собой сложные гетероциклические органические красители, полученные либо естественным путем, либо синтезированные в лаборатории. Красители характеризуются своими ультрафиолетовыми и видимыми спектрами поглощения, которые используются, чтобы отличить одно пятно от другого.Типичный спектр поглощения видимого света для трифенилметанового красителя Fast Green показан на рисунке 2. Сильная полоса поглощения с центром на 620 нанометрах отфильтровывает большую часть красных длин волн, оставляя только зеленый и синий. Fast Green — это отрицательно заряженный (анионный) краситель, используемый для избирательного окрашивания коллагена, слизи и стенок растительных клеток, придавая этим структурам цвет от сине-зеленого до темно-зеленого. Очевидно, что при использовании органических красителей для окрашивания биологических тканей необходимо учитывать впитывающие характеристики пятна.

Селективность окрашивания определяется химическими и электронными свойствами молекул красителя в отношении их взаимодействия с клеточными компонентами. Пятна, которые имеют чистый положительный заряд в водных или буферных растворах, будут выборочно прикрепляться или связываться с биологическими структурами, которые имеют отрицательный заряд. Гидрофильные пятна будут иметь тенденцию окрашивать гидратированные биологические сборки, такие как внешняя поверхность белков и нуклеиновых кислот. Пятна с гидрофобным характером разделяются на мембраны, липиды и внутреннюю часть белков.Эти свойства следует учитывать при выборе красителей для биологических тканей.

Сборник общих биологических красителей вместе с их свойствами поглощения видимого света представлен в таблице 1. Красители, используемые микроскопистами для окрашивания биологических тканей, имеют широкий спектр цветов, от темно-синего до ярко-красного, с множеством промежуточных цветов. так же доступно. Изучив таблицу, станет очевидно, что многие красители обладают схожими спектральными свойствами и, на первый взгляд, может показаться, что подобные красители могут использоваться взаимозаменяемо для окрашивания биологических образцов.Во многих случаях аналогичные красители могут быть заменены без вредных воздействий, но в некоторых случаях замещающие красители могут взаимодействовать с другими красителями или биологическими структурами непредвиденным образом, что приводит к менее желательным результатам. Это обычное явление для сложных смесей красителей, где химические и физические свойства красителей должны быть точно настроены и согласованы друг с другом. Часто замена одного красителя на другой резко меняет окрашивающие свойства смеси.

Как упоминалось выше, многие красители имеют похожие цвета и спектральные свойства.Однако при тщательном изучении их спектров поглощения в видимой части спектра красители, которые кажутся похожими, часто заметно различаются по профилям поглощения света. В качестве примера мы можем сравнить три красных красителя, которые имеют идентичные или почти идентичные спектральные характеристики: Darrow Red, Safranin O и Sudan IV. Спектры поглощения видимого света для трех красителей показаны на рисунке 3. Хотя все три красителя сильно поглощают в диапазоне от 430 до 580 нанометров (сине-зеленый) и пропускают красные длины волн, их основные максимумы поглощения различаются на целых 40 нанометров.Спектральная ширина и распределение поглощенных длин волн также различаются по всем трем спектрам. Красный Дарроу сильно поглощает длины волн в диапазоне от 400 до 460 нанометров, но сафранин О имеет небольшое поглощение в этой области. Спектр поглощения сафранина O также сдвинут на 20 нанометров в сторону более длинных волн в области 580-600 нанометров.

Электронные, химические и физические свойства трех красителей различаются даже больше, чем спектры поглощения. Сафранин О хорошо растворим в воде, но два других красителя плохо растворяются в водном или буферном растворе.Кроме того, Дарроу Ред и Сафранин О являются катионными красителями (они имеют чистый положительный заряд), тогда как Судан IV является незаряженным и нейтральным. Биологические структуры, на которые нацелены три красителя, также различаются. Красный Дарроу используется специально для структур, содержащих РНК и ДНК нуклеиновых кислот, сафранин О окрашивает сборки ядер и клеточных стенок, а Судан IV является селективным в отношении липидов и жирных веществ, присутствующих в клетках и тканях. Принимая во внимание эти факты, очевидно, что три красителя не являются взаимозаменяемыми и могут вызвать путаницу, если они будут заменены друг на друга в смеси с другими красителями.

Оптимизация контраста изображения при черно-белой микрофотографии требует тщательной настройки видимого света, проходящего через образец и попадающего на пленочную эмульсию. Чтобы обеспечить подходящую визуальную разницу между элементами образца и фоном, необходимо практическое знание спектральных характеристик видимого света как красителей, так и цветных фильтров. Спектры поглощения обычных биологических красителей опубликованы в различных источниках, но две из лучших работ — это Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes, and Indicators and H.Биологические пятна Дж. Конна . Таблица 1 содержит список наиболее часто используемых биологических красителей и спектральный диапазон полезного пропускания видимого света для каждого красителя.

Цветные фильтры можно приобрести у профессиональных поставщиков фотоаппаратов и производителей микроскопов в виде стеклянных держателей или желатиновых квадратов. Самой популярной серией фильтров для черно-белой микрофотографии являются желатиновые фильтры Kodak Wratten , которые имеют стандартную систему нумерации (см. Таблицу 2).Эти фильтры идеально подходят для критической микрофотографии с большим количеством доступных органических красителей, каждый из которых может быть точно стандартизирован с учетом количества красителя на единицу площади. Фильтры других производителей можно ссылаться на систему нумерации Kodak для определения эквивалентных фильтрационных свойств.

Фильтры Враттена состоят из тонких желатиновых пленок, смешанных с соответствующим красителем и отлитых на стеклянные пластины оптического качества, а затем оставлены для затвердевания. Затвердевшие пленки снимаются со стекла и покрываются тонким слоем лака для защиты.Фильтры Wratten легко обрезаются ножницами, чтобы их можно было модифицировать для размещения в держателях фильтров микроскопов. Хотя тонкий слой лака обеспечивает некоторую защиту хрупких фильтров, с ними следует обращаться осторожно, взявшись за углы, чтобы избежать истирания и скопления грязи и жира с кожи. Фильтры также должны быть защищены стеклянным тепловым фильтром от избыточного тепла, выделяемого лампой микроскопа. Продолжительное воздействие тепла в течение длительного периода времени может привести к потускнению фильтров.Фильтры Wratten можно чистить щеткой из верблюжьей шерсти и сжатым воздухом, но не следует подвергать прямому контакту с растворителями или водой, чтобы избежать разбухания.

Фильтры можно размещать в нескольких точках на световом пути микроскопа. Многие современные микроскопы имеют держатель, расположенный между фонарем и основанием, на который помещается несколько фильтров. В старых микроскопах держатель фильтра часто расположен прямо под конденсатором подстадия. Избегайте размещения желатиновых фильтров на световом отверстии микроскопа или в любой точке рядом с сопряженной плоскостью (рядом с полевой диафрагмой или образцом), чтобы предотвратить фокусировку царапин и других пятен в плоскости образца с помощью лезвий полевой диафрагмы.

Когда фильтры добавляются к световому пути, время экспозиции пленки должно быть отрегулировано (обычно увеличено), чтобы компенсировать поглощение света фильтром. Каждый фильтр имеет обозначенный коэффициент фильтра , который используется в качестве приблизительного руководства по настройке экспозиции при использовании этого фильтра (см. Таблицу 2). Различные условия работают вместе, чтобы влиять на воздействие данного фильтра на экспозицию, включая спектральную чувствительность пленки, цветовую температуру источника света и видимые спектры поглощения образца и пятна.

Коэффициент фильтрации для любого данного фильтра можно и нужно определять экспериментально. Выберите образец с большой площадью нейтрально-серого фона и сделайте несколько тестовых экспозиций без установленного фильтра. Целесообразно использовать скобки для микрофотографий на протяжении всего эксперимента. Затем поместите фильтр на световой путь и сделайте серию экспозиций, увеличивая с шагом от одной трети до половины диафрагмы до двух-четырех ступеней большей экспозиции, в зависимости от плотности фильтра. После выбора наилучшей микрофотографии сравните данные экспозиции и определите коэффициент фильтрации по разнице во времени экспозиции между двумя экспозициями, дающими равные плотности.

Поскольку автоматические системы камер компенсируют повышенную плотность, когда фильтры помещаются на световой путь, добавление экспозиции коэффициента фильтра обычно не требуется. Однако во многих случаях незначительные различия в спектральной чувствительности фотоумножителя или фотодиодов, измеряющих интенсивность света, падающего на камеру, могут привести к неправильной экспозиции. Глубоко окрашенные фильтры могут немного сместить фокус микроскопа из-за оптических характеристик объективов, поэтому внимательно проверяйте фокус после добавления фильтров на световой путь.Всегда визуально проверяйте окончательные микрофотографии и вручную выполняйте все необходимые корректировки.

Интерференционные фильтры также могут использоваться для увеличения контраста на черно-белой микрофотографии. Эти фильтры изготовлены с использованием нескольких тонких слоев металлических сплавов на оптическом стекле и обладают высокой точностью в отношении спектральных характеристик пропускания и поглощения. Интерференционные фильтры обозначаются как по центру, так и по ширине передаваемого диапазона длин волн.Их можно приобрести у дистрибьюторов оптики или у производителей микроскопов.

Фильтры и значения коэффициента пропускания

для черно-белой микрофотографии желтый свет )
Фильтр Светопропускание
Более 10%
Коэффициент фильтра
(F-Stops)
  • 450+ 1,5x
    8 (желтый) 470+ 1.5x
    9 (темно-желтый) 480+ 3
    11 (желтовато-зеленый) 470-540
    40 12 (темно-желтый) 510+ 2x 15 (темно-желтый) 520+ 9029 9029 желтый -оранжевый) 520+ 2x 18A (непрозрачное стекло) 320-390 540+ 22 (темно-оранжевый) 560+ 2.5x 23A (светло-красный) 570+ 24 (красный) 580+ 25 (красный) 590+ 3x 26 (красный) 600+ 9029 610+ 7.5x 32 (пурпурный) 320-500 и 600+ 33 (пурпурный) 440-440 — 34A (фиолетовый) 320-330, 410-480 & 630+ 6x 38A (синий) 9029 39 (синий) 310-480 44 (голубой-зеленый) 440-5302 440-5302 44A (голубой-зеленый) 430-550 15x 45 450-510 15292 47 (синий) 400-500 15x 47A (голубой) 380-520 (темно-синий) 400-470 57 480-580 9015 -580 10x 61 (тёмно-зелёный) 500-570 10x 64 70 (темно-красный) 660+ 74 (темно-зеленый) 9 0155520-540 89B (непрозрачный) 700+ (инфракрасный) серый янтарный 9029 560-610 и 680+ 92 (красный) 630+ 96 (нейтральный) 96 (нейтральный) ) 98 (синий) 400-470 99 (желто-зеленый) 102 (желто-зеленый) 470+ 106 (желтый) 9153 0291
    Таблица 2

    Таблицу 2 можно рассматривать как компиляцию гистограмм , представляющих характеристики пропускания фильтров Kodak Wratten для черно-белой фотографии.

    С целью выбора фильтров и пятен для черно-белой микрофотографии спектр видимого света можно разделить на три основные области, которые лежат в диапазоне длин волн от 400 до 700 нанометров. При совместном рассмотрении длины волн от 400 до 500 нанометров визуально выглядят как синий свет. Точно так же длины волн от 500 до 600 нанометров выглядят зелеными, а от 600 до 700 нанометров — красными. Краситель, который поглощает все длины волн от 400 до 500 нанометров, будет пропускать только более длинные волны от 500 до 700 нанометров (зеленый и красный свет) и будет иметь желтый цвет, который является основным субтрактивным цветом, полученным путем смешивания равных частей зеленого и красного света.Если краситель пропускает свет размером от 400 до 500 нанометров и поглощает свет с более длинными волнами (от 500 до 700 нанометров), он будет казаться синим.

    В качестве примера мы рассмотрим спектр поглощения Конго Красного (приведен в Таблице 1), который имеет сильное поглощение в области от 400 до 560 нанометров. Конго красный поглощает волны синего света с длиной волны от 400 до 500 нанометров, а также длины волн зеленого света от 500 до 560 нанометров. Краситель передает только более длинные волны от 560 до 700 нанометров, поэтому краситель визуально выглядит красным.Толуидиновый синий и трипановый синий передают волны синего цвета и поглощают более длинные волны, однако для человеческого глаза кажется, что эти два красителя имеют немного разные оттенки. Это связано с тем, что трипановый синий поглощает все длины волн выше 500 нанометров, в то время как толуидиновый синий поглощает только те длины волн, которые превышают 560 нанометров, и пропускает зеленые волны в диапазоне от 500 до 560 нанометров. Таким образом, трипановый синий имеет глубокий насыщенный синий цвет, а толуидиновый синий визуально имеет сине-зеленый цвет.Различия в спектре поглощения видимого света обычных красителей (см. Таблицу 1) дают микроскописту большую свободу в выборе правильного спектрального диапазона при выборе биологических красителей.

    Фильтры действуют так же, как красители, в отношении видимого света. Фильтр Kodak номер 38A пропускает волны с длиной волны от 360 до 570 нанометров, охватывая синий и зеленый цвета. Аналогичный фильтр, номер 39 Кодака, также является синим фильтром, но пропускает или пропускает волны с длиной волны от 310 до 480 нанометров.Как и трипановый синий и толуидиновый синий, эти два фильтра пропускают свет с немного разными оттенками. Фильтры, которые передают все или большую часть двух спектральных областей, но блокируют третью (например, фильтр Kodak 39), часто называют фильтрами минус . Фильтр номер 39 иногда называют фильтром минус синий , потому что он может блокировать или вычитать длины волн синего цвета из спектра видимого света. Аналогичным образом фильтр номер 32 кажется глазам пурпурным и называется минус-зеленым, потому что он поглощает зеленый свет в диапазоне от 500 до 600 нанометров.Фильтр номер 32 пропускает синий и красный свет в диапазонах от 320 до 500 и 600+ нанометров, которые вместе создают пурпурный цвет.

    При настройке микроскопа для черно-белой микрофотографии окрашенных образцов удобно обращаться к видимым спектрам поглощения как красителей, используемых в красителях, так и фильтров, используемых для контроля контрастности. На рисунке 4 показан ряд фильтров, используемых для контроля контраста с красителем Basic Fuchsin (Рисунок 4 (a)), который сильно поглощает свет в области от 520 до 570 нанометров и кажется красновато-пурпурным для глаза.Спектр поглощения основного фуксина показывает плечо между 460 и 500 нанометрами, которое поглощает часть (но не все) синих длин волн в этой области. Это плечо отвечает за легкий красный оттенок краски, который отличается от истинного пурпурного цвета.

    Контраст на микрофотографиях биологических образцов, окрашенных основным фуксином, будет зависеть от выбора фильтров. Фильтр, который является дополнительным фильтром к красителю, будет поглощать все или большую часть длин волн, передаваемых красителем.Этот эффект виден на рисунке 4 (b), где наложены спектры поглощения основного фуксина и фильтра Kodak номер 58. Голубые волны с длиной волны от 350 до 500 нанометров и красные волны с длиной волны выше 600 нанометров поглощаются фильтром, делая окрашенные области затемненными при захвате на черно-белую пленку, чтобы обеспечить наибольший контраст на микрофотографиях.

    Менее потемнение пятна происходит при использовании фильтра, диапазон пропускания которого шире, чем область поглощения пятна, как показано на Рисунке 4 (c).Спектр поглощения желтого фильтра Kodak номер 12, который пропускает все видимые длины волн выше 500 нанометров, наложен на основной спектр фуксина на рисунке 4 (c). Фильтр ограничивает часть длин волн красителя в диапазоне от 450 до 510 нанометров, создавая умеренный контраст на получаемых микрофотографиях.

    Минимального затемнения пятна можно добиться, выбрав фильтр, поглощающий свет в той же области, что и краситель. Фильтр Kodak 47B имеет видимый спектр поглощения, подобный по распределению длин волн базовому фуксину (рис. 4 (d)), и позволяет получать микрофотографии с меньшим контрастом, чем фильтры с номерами 12 и 58.Другие пятна можно сравнить с фильтрами аналогичным образом для точной настройки освещения микроскопа для черно-белой микрофотографии.

    Сравнение черно-белых микрофотографий комбинаций краситель / фильтр помогает понять концепцию фильтрации в микрофотографии. На рисунке 5 показаны два примера, в которых контраст образца резко увеличивается за счет использования дополнительных фильтров. Фиг.5 (a) и (b) представляют собой микрофотографии окрашенной ткани подвздошной кишки (кишечника) человека, сделанные без фильтра (Рисунок 5 (a)) и с фильтром, который поглощает большую часть цвета красителя (Рисунок 5 (b)).В этом случае пятно очень бледное и требует некоторой корректировки, чтобы ткань могла отличаться от фона. Повышение контраста, создаваемое фильтром, помогает образцу выделиться на сером фоне за счет затемнения цвета образца без значительного влияния на фон. Микрофотографии на рисунках 5 (c) и (d) — еще один пример использования фильтров для повышения контрастности образца. Окрашенный тонкий срез (рис. 5 (c)) семенников морской звезды темнеет (рис. 5 (d)), когда к световому тракту микроскопа добавляется дополнительный фильтр.Затемнение пятна помогает выявить детали межклеточной структуры на этих окрашенных участках, но при выборе фильтра необходимо проявлять осторожность, чтобы избежать слишком большого контраста.

    Фильтры также могут использоваться для усиления контраста и детализации образцов, окрашенных более чем одним цветом. На микрофотографиях, представленных на рис. 6 (а) и (b), показан тонкий срез ткани легких человека, пораженной бронхопневмонией. Без фильтрации (рис. 6 (а)) фон темный и имеет тенденцию скрывать важные детали образца в легочной ткани.При правильной фильтрации (рис. 6 (b)) фон, который не имеет значения, становится более светлым, и та часть образца, которая содержит наиболее важную информацию, становится более видимой. Точное количество и тип фильтрации для оптимизации этого эффекта должны быть определены экспериментально.

    Чтобы осветлить пятно или компенсировать чрезмерное окрашивание образца, в световой тракт микроскопа следует вставить фильтр того же цвета, что и пятно. На рис. 6 (с) показан сильно окрашенный тонкий срез стебля липы, инфицированный грибком Puccinia graminis .Пятно настолько толстое, что детали прорывающейся пустулы не видны, но этот артефакт компенсируется на рисунке 6 (d) путем добавления фильтра, имеющего те же характеристики поглощения, что и пустула. В этом случае осветление пятна помогло снизить контраст изображения и выявить детали, которые были затемнены слишком большим количеством пятна.

    К использованию контроля контрастности с помощью фильтров следует подходить с осторожностью. Окончательное изображение зависит как от соответствующего выбора фильтров, так и от определения того, какая часть образца должна быть отрегулирована.Слишком большой контраст может ухудшить ситуацию, а слишком низкий контраст часто приводит к тому, что изображениям не хватает деталей, чтобы быть полезными. Мы рекомендуем поэкспериментировать, осмотрев фильтры с установленным образцом и сравнив характеристики пропускания фильтра и поглощения пятен. Часто результаты можно улучшить, разместив на пути света различные фильтры до достижения наилучшего контраста. Черно-белая пленка относительно дешевая, поэтому проверяйте результаты, полученные с различными фильтрами, экспонируя панхроматическую пленку как можно чаще.

    Круг цветового фильтра Kodak (Рис. 7) содержит информацию о начальных точках регулировки контрастности с использованием панхроматических пленок. Эту таблицу следует использовать в качестве руководства при выборе цветных фильтров для повышения контрастности образца и выделения важных деталей на фоне. Поскольку цвета пятен и их видимые спектры поглощения значительно различаются, окончательный выбор фильтра будет зависеть от образца и смеси пятен или пятен. Панхроматические фотографические эмульсии различаются по своей реакции на красный, зеленый и синий свет и должны быть тщательно протестированы перед записью важных данных.Как правило, следует использовать желто-зеленый фильтр, такой как Kodak number 11, для установления правильных оттенков серого в многократно окрашенных образцах. При использовании дневного освещения (ксеноновая лампа или фотовспышка) вставьте желтый фильтр номер 8, чтобы компенсировать более высокую долю присутствующего синего света с этой цветовой температурой. Некоторые панхроматические пленки обладают высокой чувствительностью к красному, и их следует использовать с фильтром номер 13 для вольфрамово-галогенного освещения или фильтром номер 11 для освещения дневным светом.Следует отметить, что эти фильтры предназначены исключительно для черно-белой микрофотографии и не могут использоваться с цветной пленкой. Предлагаемые фильтры, перечисленные в таблице 3, служат отправной точкой при выборе фильтров для повышения контрастности.

    Предлагаемые комбинации фильтров и пятен
    Пятно Контрастный фильтр
    Синий Зеленый Желтый 9015 9015 Голубой 9095 909 Желтый Красный
    Оранжевый G x
    x
    9015 Eosin — Кислотный фуксин x
    x x x синий x x Метиленовый синий x x Прусский синий 90 153 x x x Tol x x Трипановый синий x x Светло-зеленый SF x Красный Конго x 901 53 Нейтральный красный x x x x Нигрозин x x

    Комбинации красителей сопротивляются попыткам создания адекватного контраста между деталями образца и фоном.Это происходит, когда два цвета пятен имеют одинаковые значения яркости, и фильтры используются для регулировки цветовой температуры подсветки микроскопа для черно-белой пленки. Лекарство состоит в том, чтобы найти фильтр, который почти полностью поглощает один из цветов и частично поглощает другой цвет, так что оба будут иметь хороший контраст на фоне.

    Поскольку цвета биологических пятен могут различаться в зависимости от образца, не всегда можно рекомендовать конкретный фильтр, даже если спектральные характеристики красителей известны.Рассмотрим голубовато-пурпурное пятно, подобное кристально-фиолетовому, которое пропускает как красные, так и синие волны. Использование светло-красного светофильтра Kodak Wratten 23A с этим красителем позволит передавать некоторые из длин волн красного цвета, но фильтр не удалит полностью цвет из красителя. Аналогичные результаты получены и с другими распространенными красными фильтрами, включая числа Враттена 24, 25 и 26. Однако все обычные красные фильтры полностью поглощают длины волн чистого синего красителя, такого как толуидиновый синий.В случае Crystal Violet темно-зеленый фильтр (число Враттена 58), вероятно, является лучшим выбором для повышения контрастности. После добавления фильтра к световому пути всегда проверяйте контраст образца через окуляры, прежде чем приступить к микрофотографии.

    В дополнение к контролю контрастности, фильтры могут использоваться для преодоления оптической аберрации и улучшения разрешения изображения. Объективы микроскопов не одинаково хорошо корректируют оптические аберрации по всему спектру видимого света.В черно-белой микрофотографии фильтры могут использоваться для использования только той части светового спектра, в которой объективы имеют оптимальные характеристики, что обеспечивает наилучшее возможное качество изображения. Ахроматические объективы корректируются на свет в зеленой части спектра на длинах волн с центром около 550 нанометров. Освещение микроскопа можно регулировать, добавляя зеленые фильтры с узкой полосой пропускания к оптическому пути (до образца), чтобы воспользоваться этим поправочным коэффициентом.Фильтры Kodak Wratten с номерами 58, 61 или 99 используются для ограничения полосы пропускания света микроскопа областью 500-600 нанометров с целью оптимизации микрофотографии при использовании ахроматических объективов. Пропускную способность можно еще больше ограничить, добавив желтый фильтр (номер Kodak 15 или аналогичный). Флюоритовые и апохроматические объективы лучше корректируют хроматические аберрации и не получают существенного преимущества от монохроматического освещения при черно-белой микрофотографии.

    Фильтры

    также могут помочь обеспечить умеренное увеличение разрешения, когда ширина полосы освещения использует только самые короткие видимые длины волн, которые лежат в области 380-400 нанометров. Добавление синего фильтра Kodak номер 47B к световому пути микроскопа ограничивает длину волны, проходящую через образец, до значений от 400 до 470 нанометров. В оптической микроскопии двухточечное разрешение рассчитывается по формуле:

    R (Разрешение) = λ / (2NA)

    Где R — наименьшее разрешаемое расстояние между двумя структурными элементами, λ — длина волны освещающего света, а NA — числовая апертура объектива.Из этого уравнения очевидно, что разрешение прямо пропорционально длине волны света. Более короткие длины волн приводят к более низким значениям R , таким образом, к большему разрешению. Используя это уравнение, мы можем вычислить, что для объектива с числовой апертурой, равной 0,9, разрешение будет 0,39 микрона для красного света (700 нанометров), 0,31 микрона для зеленого света (550 нанометров) и 0,22 микрона для синего света (400 нанометров). ). Поэтому для достижения максимального разрешения, независимо от степени оптической коррекции объектива, микроскопист может добавить синие фильтры на световой путь микроскопа.

    Микрофотографии, представленные на рисунке 8, иллюстрируют эффекты повышения разрешения с использованием монохроматического света, создаваемого фильтрами для черно-белой микрофотографии. Миниатюрные бермы на поверхности компакт-диска были сфотографированы с использованием пленки Kodak Technical Pan и 100-кратного планахроматического объектива отраженного света с вольфрамово-галогенной подсветкой, работающей при цветовой температуре 3200 К. Микрофотография слева (рис. 8 (а)) была получена. сделано без фильтрации с использованием только белого света от источника освещения.Справа (рис. 8 (b)) представлена ​​микрофотография, сделанная с фильтром Kodak номер 47B (синий), вставленным в световой тракт. Обратите внимание на повышенную четкость и резкость выступов при освещении синим светом, пропускаемым фильтром.

    Фильтры для черно-белой микрофотографии могут иметь такое же важное значение, как и фильтры, необходимые для правильной цветопередачи при цветной микрофотографии. Выполняя критическую работу с черно-белой пленкой, всегда обращайте внимание на характеристики эмульсии (они опубликованы в Интернете или прилагаются к упаковке пленки) и используйте их в качестве отправной точки для выбора фильтра.Тщательно выбирая соответствующие цветные фильтры для черно-белой микрофотографии, любой микроскопист может получить отличные черно-белые изображения с достаточным контрастом и раскрыть важные детали об образце.

    Соавторы

    Мортимер Абрамовиц — Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive., Мелвилл, Нью-Йорк, 11747.

    Майкл У. Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 Ист. ., Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

    Глубокое обучение для виртуального гистологического окрашивания светлых микроскопических изображений немеченой ткани сонной артерии

    Подготовка образца и получение изображений

    Крысы с повреждением баллона сонной артерии (самцы SD, (200–250 г, приобретено в экспериментальном центре животных больницы общего профиля Китайской НОА) модель была построена с использованием ранее хорошо зарекомендовавшего себя метода [22]. Поврежденную артерию асептически иссекали у умерщвленных животных, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали 4% -ным забуференным формалином в течение 24 часов при 4 ° C в темноте.Были собраны 4-мкм поперечные срезы залитой парафином сонной артерии крысы и сразу же визуализированы с помощью инвертированного микроскопа (Leica DM IL LED), снабженного объективом × 10 / 0,22 NA. После получения изображений немеченых срезов ткани в светлом поле соответствующие слайды гистологически окрашивали гематоксилином и эозином (H&E), пикросириусом красным (PSR) и орсеином. Изображения срезов, окрашенных H & E, PSR и орсеином, были получены с той же конфигурацией микроскопа. Эти методы окрашивания тканей выполняются только для обучения и проверки предлагаемого подхода.Образцы были получены из отделения кардиологии Главного госпиталя Китайской НОАК и подготовлены гистологической лабораторией Главного госпиталя Китайской НОАК. Все эксперименты на животных были одобрены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Китайской больницы общего профиля PLA.

    Подготовка набора данных для обучения

    Наши виртуальные сети окрашивания преобразовали изображения неокрашенных тканей в изображения, окрашенные H & E, PSR и орсеином.После получения изображений в светлом поле неокрашенные предметные стекла подверглись стандартной процедуре гистологического окрашивания. Чтобы получить входные и целевые изображения с одинаковым разрешением и полем обзора (FOV), микроскопические изображения неокрашенных срезов и соответствующих окрашенных срезов выполнялись в одной и той же системе визуализации. Однако неокрашенные ткани могут деформироваться при гистологическом окрашивании. Следовательно, очень важно регистрировать FOV пар изображений, нацеленных на ввод. В этой работе мы выполнили жесткую регистрацию для совмещения неокрашенных и окрашенных изображений.Мы получили 60 изображений для неокрашенных групп, окрашенных H & E, PSR и орсеином. Всего было получено 240 изображений целого слайда (WSI). Каждый WSI (1079 × 1079 пикселей) был случайным образом обрезан на 25 меньших перекрывающихся участков (500 × 500 пикселей). После удаления пятен без интимы и среды мы получили пары обучающих изображений (1800, 1500 и 1500) и тестовые пары изображений (200, 150 и 150) для виртуального окрашивания H&E, PSR и орцеина соответственно.

    Архитектура условной генеративной состязательной сети

    Чтобы изучить нелинейное отображение неокрашенных изображений на стандартное гистологическое окрашивание образца, мы использовали условную генеративную состязательную сеть (cGAN) [23], которая является расширением генеративной состязательной сети (GAN). ) [24].GAN основан на сети обучения с глубокой сверткой, которая состоит из двух сетей: генератора (G) и дискриминатора (D). G отвечает за создание новых изображений из предыдущего распределения случайных данных путем моделирования распределения данных реального изображения. Дискриминатор D изучает правило различения изображений, генерируемых G, или реальных изображений гистологического окрашивания в нашем случае. Эти две сети имеют конкурентные отношения и проходят обучение одновременно.

    В этой работе генератор D и дискриминатор G cGAN содержали архитектуру U-net [25] и PatchGAN [26], соответственно, как показано на рис.2. Архитектура cGAN была обновлена ​​со следующими изменениями: путь понижающей дискретизации изучает контекстную информацию изображения и целевое местоположение пути повышающей дискретизации, добавленное в модель cGAN для облегчения ввода изображений размером 500 × 500 пикселей.

    Чтобы получить результаты без генерации размытых изображений, мы выбрали норму L1 вместо штрафа L2-нормы (среднеквадратичная ошибка) в качестве функции стоимости [23, 27]. Мы определили функцию потерь cGAN следующим образом:

    $$ {L} _ {\ mathrm {cGAN}} \ left (G, D \ right) = {E} _ {x, y \ sim {p} _ {\ mathrm {data}} \ left (x, y \ right)} \ left [\ log D \ left (x, y \ right) \ right] + {E} _ {x \ sim {p} _ {\ mathrm {data}} (x)} \ left [\ log \ left (1-D \ left (x, G (x) \ right) \ right) \ right], $$

    , где x — вход неокрашенное изображение для генератора, y — основное истинное изображение (соответствующее гистологическое окрашенное изображение в нашем случае), z — случайный шум, добавленный в качестве исключения в этой работе, p data ( x , y ) — это совместное распределение вероятностей обучающих данных, включая пары входного изображения x и основного истинного изображения y , а также \ ({E} _ {x, y \ sim {p} _ {\ mathrm { data}} \ left (x, y \ right)} \) — математическое ожидание логарифмической вероятности ( x , y ).Чтобы уменьшить размытость и создать формирующие изображения, член регуляризации L1 был выбран следующим образом:

    $$ {L} _ {L1} (G) = {E} _ {x, y, z} \ Big (\ left \ Vert {\ left.yG \ left (x, z \ right) \ right \ Vert} _1 \ right). $$

    Глобальная цель затрат на состязательное обучение в cGAN определяется следующим образом:

    $$ \ mathrm {G} = \ arg \ underset {G} {\ min} \ underset {D} {\ max} {L } _ {\ mathrm {cGAN}} \ left (G, D \ right) + \ lambda {L} _ {L1} (G). $$

    Параметр регуляризации λ эмпирически выбран равным 100, чтобы уравновесить состязательную потерю и глобальную потерю.Ядра свертки cGAN были установлены равными 4 × 4. Эти ядра были случайным образом инициализированы с использованием равномерного распределения с минимальным значением 0. Мы устанавливаем все смещения как случайное равномерное распределение. В наших экспериментах использовался коэффициент отсева 0,5. Мы обучили нашу виртуальную модель сети окрашивания в течение 200 эпох со скоростью обучения 0,001 для сети генератора и 0,0002 для сети дискриминатора. В нашем обучении использовался оптимизатор Adam с размером пакета 1 и экспоненциальной скоростью затухания 0,5.На каждую итерацию дискриминатора приходилась одна итерация генераторной сети.

    Реализация

    Наша виртуальная сеть окрашивания была реализована с использованием Python версии 3.6.9. CGAN был реализован с использованием TensorFlow версии 1.12.0. Другие используемые библиотеки Python: cv2, os, time, tqdm, библиотека изображений Python (PIL), SciPy, glob, ops, sys и numpy. Мы реализовали программное обеспечение на настольном компьютере с процессором Core i7-8700K с тактовой частотой 3,20 ГГц (Intel) и 12 ГБ оперативной памяти, работающим под управлением Linux 4.15.0 операционная система. Все эксперименты, включая обучение сети и тестирование, проводились на графическом процессоре Nvidia GeForce RTX 2080Ti. Другие детали реализации, включая количество обученных патчей, количество эпох и время обучения, суммированы в Приложении. Таблица 2.

    Evaluation

    Расчет площади интимы, среды и соотношения интима-среда для виртуального и стандартного окрашивания в срезах ткани был выполнен с использованием пакета ImageJ FIJI (версия 1.51) [28].Данные были представлены как среднее значение ± SD (стандартное отклонение).

    Гистология: пятна и интерпретация срезов

    При наблюдении образца ткани под световым микроскопом часто бывает трудно различить разные клетки и ткани, поскольку они почти бесцветны. Поэтому окрашивание используется для создания дифференциальной окраски, что позволяет более четко наблюдать и анализировать клетки.

    Окрашивание широко используется в гистопатологии и диагностике, так как позволяет выявлять отклонения в количестве и структуре клеток под микроскопом.В гистологии используется огромное количество красителей, от красителей и металлов до меченых антител. Некоторые пятна значительно изменяют окраску клеток и тканей, отличаясь от цвета исходного красочного комплекса, явление, известное как метахромазия. Для окрашивания обычно используют парафиновые срезы ткани. Они регидратируются, а затем становятся полупрозрачными (очищаются) с помощью очищающего вещества, такого как ксилол, перед окрашиванием. В этой статье описаны наиболее распространенные красители, используемые в гистологии.

    Специальные морилки

    Специальные красители используются для идентификации и демонстрации определенных структур и тканей, которые не визуализируются окрашиванием H&E. Существует множество специальных пятен, краткая информация о некоторых из них приведена ниже.

    Ван Гизон

    Окрашивание по Ван Гизону — очень распространенное окрашивание, используемое для выделения разницы между коллагеном и другой соединительной тканью , такой как мышечные ткани. Его часто используют для определения характерного расположения волокон при разных типах опухолей.Краситель использует смесь пикриновой кислоты и кислого фуксина для проникновения в образец ткани, в результате чего коллаген становится красным . Окружающие мышечные ткани и клетки крови окрашены в желтый .

    Окрашивание по Ван Гизону

    Пикриновая кислота Молекулы очень малы и поэтому проникают во все типы тканей. Однако они полностью задерживаются только в красных кровяных тельцах и мышцах, так как они имеют тонкую плотную структуру. Кислый фуксин имеет более крупные молекулы, которые проникают в коллаген, вытесняя молекулы пикриновой кислоты.Это приводит к тому, что коллаген окрашивается иначе, чем мышцы и красные кровяные тельца, что позволяет дифференцироваться. В настоящее время вещество под названием ponceau S часто используется в качестве заменителя кислого фуксина, поскольку оно немного более эффективно.

    Для проведения окрашивания по Ван Гизону выполняются следующие шаги:

    • Секция регидратируется, а затем очищается с использованием ксилола
    • Срез окрашивают последовательностью целестин синий-гематоксилин для окраски ядер
    • Избыток смывается водой
    • Срез погружают в краситель по Ван Гизону на 1-5 минут
    • Повторная промывка дистиллированной водой
    • Затем его обезвоживают этанолом и очищают с помощью ксилола
    • Секция крепится с использованием смолистой среды

    Толуидиновый синий

    Толуидиновый синий, иногда называемый хлоридом толония, представляет собой тип метахроматического красителя, который является ацидофильным, что означает, что он окрашивает кислые ткани .Его особенно привлекают нуклеиновые кислоты, и поэтому он используется для окрашивания тканей с высокими концентрациями ДНК и РНК . При контакте с толуидиновым синим нуклеиновые кислоты приобретают синий цвет, а муцины и хрящи становятся пурпурными. Он используется для идентификации гранул тучных клеток, муцинов и хрящей.

    Окрашивание хряща трахеи толуидиновым синим (гистологический препарат)

    Основная процедура окрашивания толуидиновым синим следующая:

    • Срез ткани увлажняется дистиллированной водой
    • Секция погружается в Toluidine Blue на несколько минут
    • Избыток смывается дистиллированной водой
    • Затем его обезвоживают этанолом и очищают с помощью ксилола
    • Секция крепится с использованием смолистой среды

    Альцианский синий

    Альциановый синий — один из альциановых красителей, представленных еще в 1948 году.Другие альциановые красители включают альциановый желтый и альциановый зеленый. Это семейство поливалентных основных красителей содержит 2-4 изотиоурониевых групп, имеющих положительный заряд.

    Альциановый синий — это фталоцианиновый краситель, который проявляет специфичность к таким веществам, как гликозаминогликаны и кислые муцины . Чтобы охарактеризовать подтипы кислых муцинов, pH раствора альцианового синего варьируется и регулируется. Окрашивание альциановым синим приводит к тому, что кислые муцины и слизистые вещества выглядят синим , а ядра становятся красноватыми розовыми при использовании контрастного нейтрального красного цвета.Красители Alcian Blue растворимы в воде и кажутся синими, поскольку содержат медь. Они присоединяются к мукополисахаридам и гликопротеинам сульфатов и карбоксилированных кислот, а связывание красителей является чисто электростатическим. Это окрашивание проводят, чтобы увидеть мукоидную дегенерацию и идентифицировать кислые муцины, которые выделяются различными опухолями соединительной и эпителиальной ткани . Процедура окрашивания обычно проводится так:

    • Секция гидратирована дистиллированной водой
    • Он погружен в альцианский синий (время в альциановом синем может варьироваться)
    • Затем его промывают в водопроводной воде и ополаскивают дистиллированной водой
    • Ядерно-быстрый красный добавляется в качестве контрастного красителя на 5 минут
    • Затем его обезвоживают этанолом и очищают с помощью ксилола
    • Секция крепится с использованием смолистой среды

    Гимза

    Это пятно крови, которое можно использовать гистопатологически.Он был разработан в первую очередь для демонстрации малярийных паразитов. Позже он был использован в гистологии из-за его высококачественных способностей окрашивания хроматина и ядерных мембран. Он по-разному окрашивает человеческие и патогенные клетки, поэтому он используется в диагностике многих заболеваний, так как окрашивает человеческие клетки в фиолетовый цвет, а бактериальные клетки в розовый, чтобы их можно было дифференцировать. Он также используется для окрашивания клеток крови, чтобы можно было наблюдать за их составом и структурой.

    Окрашивание нейтрофила по Гимзе (гистологический препарат)

    Ядра окрашиваются в фиолетовый , а цитоплазма окрашивается от синего до бледно-розового , в зависимости от типа клеток.Окрашивание дифференцирует гранулы различных клеток крови , окрашивая их в разные цвета. Базофилы имеют темно-синие гранулы, а эозинофилы — оранжевые.

    Процесс окрашивания выглядит следующим образом:

    • Пленка крови воздушная сухая
    • Затем его погружают в краситель Гимза на 1-2 минуты
    • Его погружают в деионизированную воду на 2–4 минуты, а затем промывают деионизированной водой
    • Затем воздух осушенный

    Ретикулин

    При окрашивании

    ретикулином используется пропитка серебром секции, чтобы выделить волокон ретикулина (коллаген III типа).Он в основном используется в гистопатологии печени, но также может использоваться для оценки нарушений в селезенке, костном мозге и почках. В печени и некроз, и цирроз вызывают нерегулярный характер ретикулина. Изменения ретикулина также могут сигнализировать о наличии опухолей.

    Окрашивание ретикулином костного мозга при миелопролиферативном заболевании (гистологический слайд)

    Окрашивание вызывает окрашивание волокон черным , которое контрастирует с более светлым серым или розовым фоном .Во время процедуры окрашивания ткань сначала должна быть окислена, а затем сенсибилизирована квасцами железа перед добавлением серебра. После добавления серебра его необходимо уменьшить с помощью формалина, чтобы оно стало видимым. Ядра также могут быть контрастно окрашены красным , используя ядерно-быстрый красный, чтобы сделать их видимыми.

    Процесс окрашивания описан ниже:

    • Гидратация секции осуществляется дистиллированной водой
    • Погружается в раствор манганата калия на 5 минут
    • Моется в водопроводной воде
    • Добавляют 5% щавелевую кислоту , затем смывают дистиллированной водой
    • Срез сенсибилизируется квасцами в течение 10 минут
    • Промывают в водопроводной воде и ополаскивают дистиллированной водой
    • Затем его несколько раз окунают в раствор серебра , а затем в дистиллированную воду
    • Погружен в 10% раствор формальдегида на 30 секунд
    • Промывается дистиллированной водой
    • Хлорид золота добавляют в течение 1 минуты и смывают дистиллированной водой
    • Затем срез погружают в 5% гипо на 1 минуту и ​​смывают в водопроводной воде
    • Ядерно-быстрый красный добавляется в качестве контрастного красителя на 5 минут
    • Затем его обезвоживают этанолом и очищают с помощью ксилола
    • Секция крепится с использованием смолистой среды

    Ниссл

    Окрашивание

    по Нисслю используется для визуализации субстанции Ниссля (скопления шероховатого эндоплазматического ретикулума и свободных полирибосом), которая обнаруживается в нейронах.Этот краситель отличает нейроны от глии, и цитоархитектура нейронов может быть хорошо изучена с помощью этого красителя. Потеря вещества Ниссля может означать такие аномалии, как повреждение или дегенерация клеток, что, в свою очередь, может указывать на заболевание.

    Окраска по Нисслю телец Ниссля (гистологический препарат)

    Обычно используемый краситель для этого окрашивания называется Cresyl Echt Violet Acetate, который смешивают в растворе с дистиллированной водой. Это окрашивает вещество Ниссля в темно-синий или темно-фиолетовый цвет.

    Для окрашивания по Нисслю используются следующие шаги:

    • Секция гидратирована дистиллированной водой
    • Погружается в Cresyl Echt violet ацетат на 2 минуты
    • Промывается дистиллированной водой
    • Затем его обезвоживают этанолом и очищают с помощью ксилола
    • Затем секция монтируется с использованием смолистой среды

    Орсеин

    Окрашивание орсеином используется для идентификации телец включения вирусов.Это вирусные частицы в клетках человека, которые можно увидеть с помощью световой микроскопии, в отличие от самих вирусов. Окраска Орсеина обычно используется для диагностики гепатита В, который вызывает образование телец включения в гепатоцитах. Orcein состоит из смеси амино- и гидроксифеноксазоновых соединений. В результате окрашивания тельца включения окрашиваются в темно-коричнево-фиолетовый цвет . Белки, связанные с медью, также становятся темно-пурпурными. В процедуре используется раствор Орсеина в сочетании с 70% этанолом и соляной кислотой.

    Окрашивание эластичных пластинок Орсеином (гистологический препарат)

    Процесс окрашивания Орсеина выглядит следующим образом:

    • Гидратация секции осуществляется дистиллированной водой
    • Окунуть в раствор перманганата калия на 10 минут
    • Мыть в воде
    • Окунуть в 5% щавелевую кислоту до бесцветного состояния
    • Умывальник вода
    • 0.5% Затем добавляют периодическую кислоту в течение 5 минут
    • Затем его промывают в водопроводной воде и ополаскивают дистиллированной водой
    • Затем срез погружают в раствор Орсеина от 4 до 16 часов при комнатной температуре
    • Промывается этанолом
    • Затем его обезвоживают этанолом и очищают с помощью ксилола
    • Секция крепится с использованием смолистой среды

    Судан черный B

    Это неионный гидрофобный краситель, используемый для идентификации липидов и липофусцинов .Липофусцины — это возрастные пигменты, встречающиеся у пожилых людей в постоянных клетках, таких как нейроны и клетки сердца. Липофусцин образуется в результате сборки лизосом, которые поглотили неперевариваемые части клеток. Как следует из названия, Sudan Black B окрашивает липофусцины в черный . Его обычно используют для окрашивания липидов и жиров, поэтому важно то, что он окрашивает липофусцины. Он также может окрашивать эритроциты в черный цвет.

    Чтобы провести окрашивание Судана Black B, необходимо выполнить следующие шаги:

    • Образец гидратирован спиртом
    • Затем погружают в суданский черный на ночь
    • Затем промывают в этаноле и промывают в водопроводной воде
    • Затем секция монтируется с использованием водной монтажной среды

    Трихром Массона

    Трихромные пятна, как следует из названия, представляют собой смесь трех красителей, используемых для дифференциации мышц, , коллагеновых волокон, , фибрина, и эритроцитов, в соединительной ткани.Один из трех красителей обычно является ядерным красителем, а два других красителя в основном дифференцируют коллаген и мышечные волокна.

    Трихром Массона — одно из часто используемых красителей трихрома, используемых для подчеркивания разницы между коллагеном и мышечной тканью, как по Ван Гизону. Он широко используется для оценки коллагена при различных патологиях , например, при циррозе печени или опухолях. Три разных красителя в этом пятне имеют молекулы разного размера, которые по-разному проникают в ткани.Там, где могут проникать более крупные молекулы, более мелкие вытесняются. Сначала используется кислый краситель, такой как алый Бибрих, затем фосфорновольфрамовая и фосфорно-молибденовая кислоты и, наконец, краситель для волокон, например, светло-зеленый. Гематоксилин железа Вейгерта также используется, но в качестве фиксатора в начале процедуры. После окрашивания ядра выглядят черноватыми или синими , мышца и фибрин выглядят красными , а коллаген появляется зеленым .

    Окрашивание трихромом Массона, показывающее легочную гипертоническую артериопатию (гистологический слайд)

    Обычные этапы окрашивания парафиновых срезов перечислены ниже:

    • Секция регидратируется, а затем очищается с использованием ксилола
    • Затем его очищают спиртом и ополаскивают дистиллированной водой
    • Окрашивают железным гематоксилином Вейгерта в течение 5-10 минут
    • Секция снова промывается дистиллированной водой
    • Затем его погружают в фуксин алой кислоты Бибриха на 5-10 минут
    • Избыток смывается дистиллированной водой
    • Затем окрашивают фосфовольфрамом и фосфомолибденовой кислотой в течение 10 минут
    • Сразу после окрашивания светло-зеленым в течение 5 минут
    • Избыток снова смывают дистиллированной водой
    • Затем секцию обезвоживают этанолом и очищают ксилолом
    • Крепится с использованием смолистого материала

    Трихром Мэллори

    Этот краситель также различает коллаген и мышечные волокна .Среди трех красителей первый — это разбавленный кислый фуксин, второй — разбавленная фосфорно-молибденовая кислота, а третий — смесь оранжевого G, метилового синего, щавелевой кислоты и дистиллированной воды. В конце процедуры ядра и мышечные клетки выглядят красными , коллаген появляется синими , а эритроциты становятся оранжевыми . Это окрашивание довольно часто используется для обнаружения изменений в гистопатологических образцах печени и почек. Окрашивание трихромом Мэллори включает следующие этапы на залитых парафином срезах:

    • Для обводнения секции использовали ксилол и этанол
    • Погружается в кислотный фуксин на 2 минуты
    • Затем промывают дистиллированной водой
    • Затем окрашивают фосфорномолибденовой кислотой в течение 2 минут
    • Повторная промывка дистиллированной водой
    • Затем его погружают в оранжевый раствор G на 15 минут
    • Ополаскивается дистиллированной водой
    • Затем его обезвоживают этанолом и очищают с помощью ксилола
    • Секция крепится с использованием смолистой среды

    Азан трихром

    Окрашивание трихромом азана, иногда называемое трихромом азана Хайденхайна, также используется для окрашивания мышцы и коллагена .Следовательно, его можно использовать для различения мышечной и коллагеновой ткани, а также для выявления заболеваний, , таких как заболевания печени. Это немного улучшенная версия трихрома Мэллори.

    Он отличает клетки от внеклеточных компонентов и окрашивает мышечные волокна в красный , хрящ и костный матрикс в синий . Как и растворы фосфорномолибденовой кислоты оранжевого G и анилинового синего Мэллори, однако вместо кислотного фуксина для окрашивания ядер используется краситель под названием азокармин, который сочетается с уксусной кислотой и дистиллированной водой.Анилиновый синий используется в качестве контрастного красителя азокармину для окрашивания ядер. В результате образуются красные ядра, оранжевых, мышечных клеток и синий коллаген, что позволяет дифференцировать их под микроскопом. Процедура окрашивания следующая:

    • Секция опорожняется ксилолом и этанолом
    • Затем его погружают в раствор азокармина на час при 50 градусах Цельсия
    • Затем промывают дистиллированной водой
    • Затем срез помещают в раствор анилина и 100 мл этанола в сочетании с 0.1 мл соляной кислоты
    • Промыть дистиллированной водой
    • Затем его погружают в фосфорно-молибденовую кислоту на 2 часа
    • Затем его помещают в смесь оранжевого G , анилинового синего , уксусной кислоты и дистиллированной воды на 2–3 часа
    • Снова промывают дистиллированной водой
    • Затем его обезвоживают этанолом и очищают с помощью ксилола
    • Секция крепится с использованием смолистой среды

    Трихром Касона

    Как и другие трихромные красители, это краситель также используется для дифференциации коллагена .Поэтому его применение включает диагностику нарушений, связанных с аномалиями коллагена. Окрашивает ядра и цитоплазму в красный , коллаген в синий и эритроциты в оранжевый . Используемое краситель представляет собой смесь красителей, состоящую из оранжевого G, кислого фуксина, анилинового синего, фосфорновольфрамовой кислоты и дистиллированной воды. Процесс включает следующие шаги:

    • Секция опорожняется ксилолом и этанолом
    • Затем его погружают в раствор красителя на 5 минут
    • Ополаскивается дистиллированной водой
    • Затем его обезвоживают этанолом и очищают с помощью ксилола
    • Секция крепится с использованием смолистой среды

    PAS (Периодическая кислота Шиффа)

    Это краситель окрашивает гликоген и поэтому используется для проверки мембран, слизистых веществ, а также наличия грибка.Процесс окрашивания PAS обычно включает две стадии: первая — это реакция окисления периодной кислотой, приводящая к образованию альдегидов, вторая стадия — демонстрация этих альдегидов с помощью реактива Шиффа.

    Окраска клубочков по Шиффу периодической кислотой (гистологический слайд)

    Фуксиновый краситель в реактиве Шиффа дает диапазон цветов от пурпурного до пурпурного. В процессе окрашивания используются периодическая кислота, гематоксилин и реагент Шиффа, который включает основной фуксин и метабисульфит натрия в сочетании с дистиллированной водой и соляной кислотой.Окрашивание приводит к тому, что ядра становятся синими , а гликоген и грибы становятся пурпурными по цвету. PAS используется в ряде диагностических приложений . Например, его можно использовать для диагностики болезни накопления гликогена, некоторых сарком и карцином, а также грибковых инфекций. Порядок действий следующий:

    • Секция гидратирована в дистиллированной воде
    • Затем помещают в периодическую кислоту на 5 минут
    • Полоскание в дистиллированной воде
    • Затем его погружают в Реагент Шиффа на 15-30 минут
    • Излишки смываются водопроводной водой
    • Затем срез контрастировали гематоксилином в течение 1-3 минут
    • Затем его промывают в водопроводной воде и ополаскивают дистиллированной водой
    • Затем секция обезвожена этанолом и очищена ксилолом
    • Наконец, он устанавливается с использованием смолистой среды

    Резорциновый фуксин Вейгерта (резинка Вейгерта)

    Как следует из названия, этот тип морилки используется для окрашивания эластичных волокон .В результате они окрашиваются в сине-черным , ядра становятся светло-сине-черными, коллаген становится розовым или красным , а другие ткани становятся желтыми .

    Раствор включает основной фуксин, который образует комплекс, который прикрепляется к эластичным волокнам, вызывая их окрашивание. Раствор красителя Вейгерта также состоит из резорцина, хлорида железа, этанола, дистиллированной воды и соляной кислоты. Гематоксилин и краситель Ван Гизона также используются в качестве контрастных красителей.Процесс включает следующие шаги:

    • Секция гидратирована и очищена ксилолом и этанолом
    • Погружается в раствор Вейгерта на срок до часа (минимум 20 минут)
    • Промывается этанолом
    • 1% кислый спирт добавлен для дифференциации
    • Избыток смывается водой
    • Гематоксилин и ван Гизон контрастных красок добавляются
    • Затем секцию обезвоживают этанолом и очищают ксилолом
    • Крепится на смолистую среду

    Пятно Райта и Райта Гимза

    Пятна Райта и Райта Гимзы являются полихроматическими пятнами, потому что они содержат эозин и метиленовый синий .Окраска Гимзы дополнительно содержит лазурный метиленовый синий и усиливает ядерные свойства. Затем эозин Y используется для окрашивания цитоплазмы клеток оранжевым . Оба они используются для окрашивания мазков периферической крови и мазков костного мозга. Они используются для изучения клеток, а также их морфологии, помогая в диагностике инфекций и заболеваний крови, таких как лейкемия. Различные типы клеток крови окрашиваются по-разному, что позволяет наблюдателю различать их.

    Окраска эозинофила по Райту Гимзе (гистологический препарат)

    Эти изменения перечислены ниже:

    • Нейтрофилы имеют пурпурные ядра, светло-розовую цитоплазму и красновато-пурпурные гранулы
    • Базофилы имеют темно-синие или фиолетовые ядра и очень темно-фиолетовые гранулы
    • Эозинофилы имеют голубые ядра, светло-розовую цитоплазму и красные гранулы
    • Красные кровяные тельца становятся красными или розовыми
    • Тромбоциты фиолетовые
    Окраска по Райту по Гимзе (базофил) — гистологический препарат

    Процесс окрашивания крови с помощью красителя по Райту выглядит следующим образом:

    • Капля крови помещается между предметными стеклами и сушится на воздухе тонким слоем для окрашивания
    • Затем мазок помещают в пятно Райта на 1-3 минуты
    • Добавлен фосфатный буфер на этот раз в два раза
    • Затем его промывают водой и сушат промоканием

    Альдегид фуксин

    Это пятно, иногда известное как пятно альдегид-фуксина Гомори, изначально было создано для окрашивания эластичных волокон .Однако его также можно использовать для окрашивания других тканей, особенно гранул бета-клеток поджелудочной железы. Он также очень селективен с некоторыми другими базофильными сайтами с высоким сродством, такими как гранулы тучных клеток и хрящевой матрикс.

    Эластичные тканевые волокна приобретают голубовато-фиолетовый цвет , как и гранулы бета-клеток и сульфатированные муцины. Раствор альдегид-фуксина содержит смесь основного фуксина, 70% этанола, концентрированной соляной кислоты и паральдегида. Альдегид фуксин обычно используется в сочетании с альциановым синим.Для окрашивания альдегид-фуксином используется следующий процесс:

    • Секцию доводят до воды, используя этанол и ксилол
    • Затем он окисляется в 1% манганат калия
    • Затем промывают в водопроводе водой
    • Затем манганат калия удаляют 1% щавелевой кислотой
    • Затем промывают в водопроводной воде и затем этаноле
    • Срез погружают в раствор альдегид-фуксина в герметичном контейнере на 15 минут
    • Ополаскивается еще раз в этаноле , затем в водопроводной воде
    • Затем его обезвоживают этанолом и очищают с помощью ксилола
    • Секция крепится с использованием смолистой среды

    Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

    Иммунофлуоресценция — это метод, используемый в иммуногистохимии. Иммуногистохимия — это отрасль науки, которая включает использование образования комплексов антитело-антиген для выборочного изучения определенных антигенов в срезе ткани.

    Этот метод включает маркировку антител флуоресцентным маркером. Антитела будут связываться со специфическим антигеном в интересующем участке, а флуоресцентный маркер вызывает изменение цвета, которое можно увидеть под микроскопом. Этот метод полезен для выявления аномальных клеток, таких как раковые клетки.Специфические антигены, с которыми связываются антитела, можно найти в ряде областей клеток, включая цитоплазму, ядро, липиды, белки и клеточную мембрану.

    Иммуногистохимия, показывающая нервные стволовые клетки

    Сначала добавляют немеченое первичное антитело , специфичное к представляющему интерес антигену, инкубируют в течение 60 минут, а затем отмывают, используя забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Затем добавляется вторичное антитело , меченное , и инкубируется около 30 минут.Это прикрепляется к первичным антителам. Затем срез промывают PBS и устанавливают для просмотра под микроскопом. Этот метод известен как непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание . Процесс также можно проводить с использованием только меченых первичных антител, это известно как прямая иммунофлуоресценция , окрашивание .

    Основные моменты

    Окрашивание широко используется в гистопатологии и диагностике, поскольку оно позволяет выявлять отклонения в количестве и структуре клеток под микроскопом.В гистологии используется огромное количество красителей, от красителей и металлов до меченых антител. Наиболее распространенные красители, используемые в гистологии, следующие:

    • Обычные пятна
    • Особые пятна
      • Ван Гизон
      • Толуидиновый синий
      • Синий Альциан
      • Giemsa
      • Ретикулин
      • Ниссл
      • Orcein
      • Судан Черный B
      • Трихром Массона
      • Трихром Мэллори
      • Азан Трихром
      • Трихром Касона
      • Periodic Acid Schiff
      • Резорцин Вейгерта Fuchsin
      • Пятно Райта и Райта Гимзы
      • Альдегид фуксин
      • Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

    Методы окрашивания актина — протоколы окрашивания актина, окрашивание актина, актиновый зонд, Acti-краситель 488 фаллоидин, Acti-краситель 555 фаллоидин, Acti-краситель 535 фаллоидин, Acti-краситель 670 фаллоидин, актиновый краситель, актин-краситель 488.

    Протокол 1. Фиксация и окрашивание клеток тканевой культуры флуоресцентным фаллоидином (F-актин), Dapi (ДНК) и антителом.

    Есть несколько методов, которые используются для флуоресцентного окрашивания актиновых филаментов в клетках культуры ткани. Процедура фиксации имеет решающее значение для получения точного представления о распределении F-актина в клетке. Метод фиксации следует выбирать исходя из требований эксперимента. Фиксация клеток культуры ткани в параформальдегиде или глутаральдегиде приводит к отличному окрашиванию актиновых филаментов и хорошей сохранности ламеллиподий.


    Реагенты

    1. Фаллоидин Acti-Stain ™ 488 (№ по каталогу PHDG1).
    2. Полуконфлюэнтные клетки Swiss 3T3, выращенные на покровных стеклах размером 25 x 25 мм, выращенных в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% фунгизона.
    3. Получите набор для окрашивания F-актина от Cytoskeleton, Inc. (№ по каталогу BK005) или приготовьте реагенты с 4 по 8, указанные ниже.
    4. Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS, 50 мМ фосфат калия, pH 7,4, 50 мМ NaCl).
    5. Фиксирующий раствор (3.7% параформальдегида в PBS, необходим pH 7,0).
    6. Буфер для повышения проницаемости (0,5% Triton X-100 в PBS).
    7. Средство для закрепления антифадеров (Fluka BioChemika, № по каталогу 10981).
    8. Раствор бычьего сывороточного альбумина в PBS (приготовленный свежий, 10 мг / мл BSA в PBS)
    9. Первичные антитела при разведении 1: 100 в PBS плюс 1 мг / мл BSA (приготовленные свежие)
    10. Вторичные антитела (конъюгат родамина) при Разведение 1: 250 в PBS плюс 1 мг / мл BSA (приготовленный свежий)
    11. 100 нМ DAPI (4’6-диамидино-2-фенилиндол) в PBS.
    12. Стеклянное предметное стекло для микроскопа (25 x 75 x 1 мм).
    13. Раствор для герметизации покровных стекол (прозрачный лак для ногтей).

    Оборудование

    1. Флуоресцентный микроскоп с фильтром возбуждения FITC на 450-480 +/- 20 нм и эмиссионным фильтром на 535 +/- 20 нм для Acti-Stain ™ 488 и фильтром возбуждения на 355+ / — 20 нм и эмиссионный фильтр на 440 +/- 20 нм для DAPI.
    2. Цифровая камера CCD.

    Метод

    1. Выращивайте клетки культуры ткани на стеклянных покровных стеклах до полуслияния.
    2. Приготовьте 100 нМ рабочий раствор фаллоидина Acti-краситель 488, разбавив 3,5 мкл 14 мкМ меченого исходного фаллоидина в 500 мкл PBS. Хранить при комнатной температуре в темноте.
    3. Удалите питательную среду и осторожно промойте клетки один раз PBS при комнатной температуре (RT).
    4. Переместите покровное стекло на кусок парафильма во влажной камере и добавьте 200 мкл фиксирующего раствора в каждое покровное стекло на 10 мин при комнатной температуре.
    5. Вымойте клетки один раз PBS при комнатной температуре в течение 30 с.
    6. Проникновение клеток с помощью пипетки 200 мкл буфера для пермеабилизации на покровное стекло и инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре.
    7. Вымойте клетки дважды PBS при комнатной температуре в течение 30 с.
    8. Инкубируйте с 1 мг / мл BSA в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Примечание. Выделенные курсивом участки можно удалить, если окрашивание антителами не требуется.
    9. Один раз промыть PBS при комнатной температуре в течение 30 с.
    10. Внесите пипеткой 200 мкл раствора первичных антител и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа (или 2 часов в случае плотной клеточной локализации, такой как ядро).
    11. Трижды промыть PBST при комнатной температуре в течение 5 минут для каждой промывки.
    12. Пипетируйте 200 мкл раствора вторичных антител и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 1 часа (или 2 часов, если место плотных клеток, например, ядро).
    13. Трижды промыть PBS при комнатной температуре в течение 5 минут для каждой промывки.
    14. Пипетка 200 мкл 100 нМ фаллоидина Acti-Stain ™ 488 плюс 100 нМ раствор Dapi в PBS. Инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин.
    15. Промойте покровное стекло трижды в PBS по 30 с для каждой промывки.
    16. Удалите жидкость с покровного стекла, прикоснувшись к углу бумажного полотенца, и переверните каплю антибликового монтажного средства на предметное стекло.
    17. Дать высохнуть на 20 минут и покрыть лаком с каждой стороны.
    18. Любой вид сразу же. Хранить слайды в темноте при 4 ° C до 24 часов.
    19. Типичные результаты окрашивания F-актином показаны на Рисунке 3 (выше).

    Протокол 2 — Маркировка F-актина in vitro для микроскопических молекулярных исследований.

    Стабилизированные флуоресцентные актиновые филаменты являются отличным субстратом для анализов подвижности актина in vitro, используемых при изучении моторных белков миозина (2).Связывание фаллоидина Acti-Stain ™ 488 не влияет на активацию актина миозиновой АТФазы in vitro.

    Реагенты

    1. Белок актина (250 мкг, № по каталогу AKL99-A).
    2. Общий актиновый буфер (5 мМ трис-HCl pH 8,0, 0,2 мМ CaCl2; каталожный номер BSA01).
    3. 10-кратный буфер для полимеризации (500 мМ KCl, 20 мМ MgCl2, 10 мМ АТФ; № по каталогу BSA02).
    4. Фаллоидин Acti-Stain ™ 488 (№ по каталогу PHDG1).

    Оборудование

    1. 1) Флуоресцентный микроскоп с фильтром возбуждения на 450-480 +/- 20 нм и эмиссионным фильтром на 535 +/- 20 нм (блок фильтров FITC).
    2. 2) Цифровая камера CCD.

    Метод

    1. Ресуспендируйте мышечный актин кролика (№ по каталогу AKL99-A) до 1 мг / мл с 250 мкл буфера General Actin с добавлением 0,2 мМ АТФ и 1,0 мМ DTT. Хорошо перемешать и оставить на льду на 1 час.
    2. Полимеризуйте актин в 1/10 объема полимеризационного буфера в течение 1 часа при комнатной температуре.
    3. Разведите полимеризованные актиновые филаменты в 100 раз в 1х буфере для полимеризации, содержащем 70 нМ фаллоидина Acti-Stain ™ 488 (2.5 мкл 14 мкМ исходного раствора плюс 500 мкл буфера для полимеризации).
    4. Поместите 1 мкл меченого актина в каплю закрепляющей среды против выцветания на предметном стекле микроскопа.
    5. Накройте каплю покровным стеклом и удалите излишки жидкости салфеткой.
    6. Изучите флуоресцентные нити под микроскопом. Нити актина будут иметь среднюю длину 2-10 мкм и стабильны при 4 ° C в темноте в течение 1 недели.

    Протокол 3. Микроинъекция родамина мышечного актина в клетки культуры ткани.

    Реагенты

    1. Родамин мышечный актин (Кат. № AR05).
    2. Общий актиновый буфер (5 мМ трис-HCl pH 8,0, 0,2 мМ CaCl2; каталожный номер BSA01).
    3. Клетки тканевой культуры, засеянные на покровные стекла.

    Оборудование

    1. Микроинжекторный аппарат.


    Метод

    1. Ресуспендируйте мышечный актин родамина до 2 мг / мл с помощью General Actin Buffer с добавлением 0.2 мМ АТФ и 1 мМ ДТТ. Оставьте на льду на 1 час для деполимеризации олигомеров актина. Примечание: если ионы кальция влияют на клетки, родамин мышечный актин можно ресуспендировать в чистой воде.
    2. Центрифугируйте раствор мышечного актина при 14 000 x g при 4 ° C в течение 10 мин. (или лучше 100 000 x г при 4 ° C в течение 10 мин). Удалите верхние 90% надосадочной жидкости в новую пробирку и загрузите иглу для микроинъекций за счет капиллярного действия.
    3. Микроинъекция родамина мышечного актина в клетки, поддерживающие положительное давление в игле для предотвращения закупорки.Примечание: соль в среде для тканевых культур и в цитоплазме клеток может привести к полимеризации актина внутри иглы.
    4. Просматривайте клетки на предметном столике микроскопа с контролируемой температурой, используя низкое освещение и камеру CCD.

    Протокол 4. Фиксация и окрашивание клеток или срезов тканевых культур, выращенных в трехмерной коллагеновой матрице с флуоресцентным фаллоидином

    Клетки или тканевые срезы выращиваются в трехмерных коллагеновых матрицах для более точной репликации in vivo клеточной среды, которые клетки функции, чтобы изучить, как клеточная морфология и функция реагируют на внеклеточную среду, ограничивающую клетку.Чтобы точно зафиксировать целостность и структуру цитоскелета F-актина (и любые изменения, которым он подвергается) с помощью флуоресцентного фаллоидинового красителя, необходима правильная фиксация и обработка клеток / срезов. Для фиксации клеток для окрашивания фаллоидином следует избегать использования метанола и вместо него следует использовать параформальдегид или глутаральдегид, поскольку они обеспечивают отличное окрашивание актиновых филаментов и хорошее сохранение ламеллиподий.

      Протокол флуоресцентного окрашивания фаллоидином

        Реагенты

        1. Полуконфлюэнтные трехмерные клетки культуры ткани или срезы ткани (для получения этих культур см. Дополнительную информацию ниже)
        2. Acti-окрашивание 488 фаллоидин (кат.# PHDG1). Другие варианты включают Acti-Stain 535 (Кат. № PHDR1), Acti-Stain 555 (Кат. № PHDh2) и Acti-Stain 670 (Кат. № PHDN1)
        3. . Получите набор для окрашивания F-актином от Cytoskeleton, Inc. (Кат. № BK005) или приготовьте реагенты ниже
        4. Фиксирующий раствор (3,7% параформальдегида в PBS, необходим pH 7,0)
        5. Буфер для повышения проницаемости (0,5% Triton X-100 в PBS)
        6. Среда для закрепления антифад (Fluka BioChemika , Кат. № 10981)
        7. Герметизирующий раствор покровного стекла (прозрачный лак для ногтей)

        Оборудование

        1. Флуоресцентный микроскоп с фильтром возбуждения FITC на 450-480 +/- 20 нм и эмиссионным фильтром на 535 +/- 20 нм для Acti-Stain ™ 488.Для красных флуорофоров Acti-краситель фильтр возбуждения составляет 535 +/- 20 нм, а эмиссионный фильтр — 585 +/- 20 нм для красителей Acti-535 и 555. Для Acti-красителя 670 фильтр возбуждения составляет 630 +/-. 20 нм, а эмиссионный фильтр — 680 +/- 20 нм.
        2. Цифровая камера CCD.

        Метод

        Протокол окрашивания фаллоидином

        1. Восстановите фаллоидин в соответствии с инструкциями производителя. Разбавьте до рабочей концентрации, как указано в PBS.Храните рабочий запас флуоресцентного фаллоидина в темноте при комнатной температуре.
        2. Зафиксируйте клетки в коллагеновых гелях с 3,7% (об. / Об.) Параформальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре.
        3. Промыть 3 раза в PBS.
        4. Обеспечьте проницаемость клеток с помощью 0,1-0,5% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин при комнатной температуре.
        5. Промыть 3 раза в PBS.
        6. Нарежьте коллагеновые гели на ~ 1 мм 3 образцов.
        7. Окрашивать 0,165 мкМ Acti-красителем фаллоидином в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре.Примечание. Эту концентрацию, возможно, потребуется определить эмпирически. Ядра клеток при желании можно окрашивать 100 нМ DAPI в PBS вместе с фаллоидином.
        8. Промыть 3 раза PBS.
        9. Поместите окрашенные образцы на предметные стекла и осторожно надавите покровным стеклом, используя каплю антибликового монтажного средства, чтобы предотвратить фотообесцвечивание.
        10. Если возможно, закройте каждую сторону покровного стекла лаком для ногтей.
        11. Либо просматривайте, либо храните слайды в темноте при 4 ° C до 24 часов.
        12. Визуализируйте клетки в окрашенных образцах с помощью соответствующей установки флуоресцентного микроскопа. Например, конфокальный флуоресцентный микроскоп с масляными иммерсионными линзами 63X при соответствующих настройках возбуждения и излучения фильтра.
        13. Для анализа окрашивания в трехмерных гелях для определения средней яркости клеток в каждом изображении полезен набор из 5-10 репрезентативных максимальных проекций z -стеков из каждого образца.

        Протокол 5 — Фиксация и окрашивание клеток тканевой культуры антителами против панактина

        Для эффективного окрашивания антителами против панактина необходимы надлежащая фиксация и обработка клеток / срезов (см., Например, выше ).Для фиксации клеток антителами против панактина мы рекомендуем следующий метод, который использует последовательную фиксацию параформальдегида и фиксацию / пермеабилизацию метанолом с последующей пермеабилизацией Triton X-100.

          Реагенты

          1. Клетки полуконфлюэнтной культуры ткани
          2. Анти-панактиновые антитела (Кат. № AAN02).
          3. Холодный метанол
          4. Фиксирующий раствор (3,7% параформальдегида в PBS, необходим pH 7,0)
          5. Буфер для пермеабилизации (0.5% Triton X-100 в PBS)
          6. Крепежная среда для защиты от затухания (Fluka BioChemika, № по каталогу 10981)
          7. Раствор для герметизации покровных стекол (прозрачный лак для ногтей)

          Оборудование

          1. Флуоресцентный микроскоп с соответствующими фильтрами совместим с выбранной вторичной обмоткой: в методе используется фильтр возбуждения FITC на 450-480 +/- 20 нм и эмиссионный фильтр на 535 +/- 20 нм для Alexafluor ™ 488.
          2. Цифровая ПЗС-камера.

          Метод

          Метод IF (фиксация PFA / метанола / тритона X-100 клеток Swiss 3T3):

          1. Клетки 3T3 высевали на покровные стекла, покрытые полилизином и ламинином, и выращивали до подходящей плотности (~ 25% конфлюэнтность).
          2. Удалите питательную среду и один раз промойте клетки 1x PBS.
          3. Зафиксируйте клетки в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) с 3,7% PFA (параформальдегид в 1X PBS) (свежий, без метанола).
          4. Вымойте клетки два раза 1x PBS.
          5. проницаемость клеток с помощью 100% метанола 4 o C в течение 30 мин.
          6. Вымойте клетки два раза 1x PBS.
          7. Повышение проницаемости клеток с 0,5% Triton X-100 RT в течение 15 мин.
          8. Вымойте клетки два раза 1x PBS.
          9. Блочные ячейки с 1% BSA, 0.3 M глицин в 1x PBS + 0,01% Tween (PBST) в течение 60 мин RT.
          10. Инкубируйте клетки с 0,2 мг / мл AAN02 в 1x PBS в течение 90 мин при комнатной температуре.
          11. Вымойте клетки один раз 0,1% Triton-X-100 в 1x PBS.
          12. Трижды промойте клетки PBST.
          13. Инкубируйте клетки с вторичным антителом (Alexa Fluor® 488) 1: 500 в PBST в течение 60 мин при комнатной температуре (минимизируйте воздействие света).
          14. Вымойте клетки три раза с 1x PBS.
          15. Инкубируйте клетки с окрашиванием DAPI 1: 500 в 1x PBS в течение 20 минут при комнатной температуре.
          16. Вымойте клетки три раза с 1x PBS.
          17. Окуните покровные стекла в воду.
          18. Установите на предметное стекло с монтажным материалом и оставьте на 20 мин.
          19. Запечатать края лаком для ногтей на 10-20 мин.


            Сопутствующие товары


            Ссылки:


            1. Лазарид Е. и Вебер К. 1974. Антитела к актину: специфическая визуализация немышечных филаментов .PNAS USA 71, 2268-2272.

            2. Вульф Ф., Дебобен А., Баутц Ф.А., Фуалстич Х. и Виланд Т.Х. 1979. Флуоресцентный фаллотоксин, инструмент для визуализации клеточного актина. PNAS USA71, 4498-4502.

            3. Вебер К., Ратке П.С. и Осборн М. (1978). Изображения микротрубочек цитоплазмы в клетках культуры ткани, фиксированных глутаральдегидом, с помощью электронной микроскопии и иммунофлуоресцентной микроскопии. PNAS USA75, 1820-1824 гг.

            4. Малое СП, Зобелей С., Риннерталер Г. и Фолстих Х.1988. Кумарин-фаллоидин: новый зонд актина, позволяющий проводить тройную иммунофлуоресцентную микроскопию цитоскелета. Журнал клеточной науки, 89, 21-24.

            5. Lefevre C, Kang HC, Haugland RP, Malekzadeh N, Arttamangkui S. и Haugland R. 1996. Texas Red-X и Rhodamine Red-X, новые производные сульфородамина 101 и лиссамина родамина B с улучшенными метками и флуоресцентными свойствами . Bioconjugate Chem., 7, 482-489.

            6. Сан У. С., Джи К. Р., Клауберт Г. Х. и Хафланд Р. (1997).Синтез фторированных флуоресцеинов. J. Org. Chem. 62, 6469-6475.

            7. Вестфаль. M, Jungbluth A, Heidecker M, Mühlbauer B, Heizer C., Schwartz J-M, Marriott G, and Gerisch G. 1997. Динамика микрофиламентов во время клеточного движения и хемотаксиса отслеживается с помощью слитого белка GFP-актин. Current Biology 1997, 7,176–183.

            8. Ридл Дж., Кревенна А.Х., Кессенброк К., Хаочен Ю. Дж., Нойкирхен Д., Биста М.