Суббота , 22 января 2022
Главная / Разное / Лактацид противогрибковый: Страница не найдена — 404 Not Found

Лактацид противогрибковый: Страница не найдена — 404 Not Found

Содержание

цена, инструкция, отзывы в сети аптек Viridis

Описание

ЛАКТАЦИД ФАРМА ПРОТИВОГРИБКОВЫЙ 250МЛ

Средство для интимной гигиены Lactacyd Фарма Противогрибковый с дозатором (250 мл) специально разработан для уменьшения ощущения зуда, жжения и раздражения, вызванное грибковой инфекцией. Помогает уменьшить дискомфорт при молочнице.

Показания к применению
Lactacyd Pharma с противогрибковыми компонентами создан специально для устранения зуда, жжения, раздражения, вызванных кандидозом (молочницей). Входящий в состав экстракт календулы обладает успокаивающим действием. Средство поддерживает естественную микрофлору интимной зоны, даря чувство свежести и комфорта. Рекомендовано как дополнительное средство при лечении молочницы, а также с целью профилактики.
Как вспомогательное средство при лечении молочницы и для профилактики возникновения.

Преимущества
Обладает Противогрибковыми свойствами: Антимикотик помогает уменьшить зуд, жжение и раздражение.
Обогащен экстрактом календулы и Бисабололом – смягчают и успокаивают раздраженную интимную зону.
Мягкий щелочной pH 8 ослабляет распространение дрожжевых организмов.
Гипоалергенный.
Гинекологически тестирован.

Состав
Aqua, Lauryl Glucoside, Cocamidopropyl Betaine, PEG-55 Propylene Glycol Oleate, Propylene Glycol, Triethanolamine, PEG-120 Methyl Glucose Dioleate, Coco-Glucoside, PEG-200 Hydrogenated Glyceryl Palmate, Sodium Chloride, Phenoxyethanol, Myristamidopropyl PG-Dimonium Chloride Phosphate, Glyceryl Oleate, PEG-7 Glyceryl Cocoate, Disodium EDTA, Glycerin, Parfum, EthylhexyIglycerin, Glycol Distearate, Citric Acid, Bisabolol, Lactic Acid, Calendula Officinalis Flower Extract, Potassium Sorbate, Sodium Benzoate, Tocopherol, Hydrogenated Palm Glycerides Citrate.

Характеристики
Тип: средство для интимной гигиены
Назначение: уменьшение симптомов грибковой инфекции
Количество в упаковке: 250 мл

Лактацид Фарма ср-во дИнт Гигиены Противогрибковое 250 мл

Результаты поиска Штрих-код: 5391520947216

Наши пользователи определили следующие наименования для данного штрих-кода:

Штрих-код Наименование Единица измерения Рейтинг*
1 5391520947216 ЛАКТАЦИД ФАРМА СР-ВО ДИНТ ГИГИЕНЫ ПРОТИВОГРИБКОВОЕ 250 МЛ ШТ. 2
2 5391520947216 ЛАКТАЦИД ФАРМА ЭКСТРА ДИНТИМ ГИГИЕНЫ 250МЛ ШТ. 1
3 5391520947216 ЛАКТАЦИД ФАРМА ПРОТИВОГРИБ. ДГИГИЕНЫ 250 МЛ ШТ. 1
4 5391520947216 ЛАКТАЦИД ФАРМА ПРОТИВОГРИБКОВЫЙ 250МЛ ШТ. 1
5 5391520947216 ЛАКТАЦИД ФАРМА ЭКСТРА СР-ВО Д/ИНТИМ ГИГИЕНЫ 250МЛ УПАК 1
6 5391520947216 ЛАКТОЦИД ПРОТИВОГРИПКОВЫЙ 200МЛ ШТ. 1

* Рейтинг — количество пользователей, которые выбрали это наименование, как наиболее подходящее для данного штрих-кода

Поиск: Лактацид Фарма дИнт Гигиены Противогрибковое

Лактацид Фарма п/грибковыми комп ср-во д/интимной гигиены 250мл — Горфарма

Инструкция по применению
Производитель Состав Действие Активные компоненты Описание Специальные указания

Производитель
Омега Фарма, Нидерланды
Состав
Aqua, Lauryl Glucoside, Cocamidopropyl Betaine, PEG-55 Propylene Glycol Oleate, Propylene Glycol, Triethanolamine, PEG-120 Methyl Glucose Dioleate, Coco-Glucoside, PEG-200 Hydrogenated Glyceryl Palmate, Sodium Chloride, Phenoxyethanol, Myristamidopropyl PG-Dimonium Chloride Phosphate, Glyceryl Oleate, PEG-7 Glyceryl Cocoate, Disodium EDTA, Glycerin, Parfum, EthylhexyIglycerin, Glycol Distearate, Citric Acid, Bisabolol, Lactic Acid, Calendula Officinalis Flower Extract, Potassium Sorbate, Sodium Benzoate, Tocopherol, Hydrogenated Palm Glycerides Citrate.

Действие
Эффективность Lactacyd Pharma с противогрибковыми компонентами доказана проведёнными исследованиями, в результате которых было выявлено, что зуд в интимной зоне снижается на -97%, а жжение на -84%. Средство поддерживает естественную микрофлору интимной зоны, даря чувство свежести и комфорта.

Активные компоненты
Экстракт Календулы и Бисаболола смягчают и успокаивают раздраженную интимную зону в неблагоприятный период. Мягкий щелочной pH 8 ослабляет распространение дрожжевых организмов и помогает бороться с завышенным уровнем кислотности, способствующем развитию Candida Albicans – грибка, который вызывает кандидоз (молочницу).
Описание
Средство LACTACYD PHARMA с противогрибковыми компонентами создано как дополнительное средство при лечении кандидоза (молочницы). Противогрибковые компоненты, входящие в состав, значительно снижают неприятные симптомы от дрожжевых инфекций, таких как зуд и жжение.
Специальные указания
Lactacyd Pharma с противогрибковыми компонентами одобрено Российским обществом акушеров-гинекологов и может быть использовано не только как вспомогательное лечение, но и для профилактики возникновения молочницы.
Условия отпуска из аптек
Без рецепта

Противогрибковое действие органических кислот молочнокислых бактерий на Penicillium nordicum

Борьба с грибковым заражением особенно важна для предотвращения порчи пищевых продуктов и кормов и появления токсичных соединений, известных как микотоксины. Некоторые штаммы молочнокислых бактерий (LAB) показали способность подавлять рост грибов и производство микотоксинов. В этой работе бесклеточные супернатанты (CFS) Lactobacillus plantarum UM55 и Lactobacillus buchneri UTAD104 были протестированы против радиального роста Penicillium nordicum и продукции ОТА.Когда использовали CFS этих штаммов, радиальный рост гриба подавлялся менее чем на 20%, но продукция OTA снижалась примерно на 20%. 60%. Эти противогрибковые эффекты были вызваны органическими кислотами, производимыми LAB. CFS L. plantarum UM55 содержал молочную кислоту, фенилмолочную кислоту (PLA), гидроксифенилмолочную кислоту (OH-PLA) и индол-молочную кислоту (ILA), тогда как L. buchneri UTAD104 CFS содержал уксусную кислоту, молочную кислоту и PLA. Эти органические кислоты дополнительно тестировали индивидуально на их ингибирующую способность.Расчет ингибирующих концентраций (IC) показал, что уксусная кислота, ILA и PLA были наиболее эффективными в ингибировании роста P. nordicum и продукции OTA. Когда тестировали ингибирующую активность LAB-клеток, включенных в культуральную среду, L. buchneri UTAD104 полностью подавляла продукцию OTA во всех тестируемых условиях, но рост грибов полностью подавлялся только при самых высоких концентрациях клеток. Основной причиной этого эффекта было производство уксусной кислоты. В заключение, способность LAB ингибировать микотоксигенные грибы зависит от способности штамма продуцировать определенные органические кислоты, и эти кислоты могут отличаться от штамма к штамму.Кроме того, использование LAB-клеток, особенно из L. buchneri, в пищевых продуктах, склонных к заражению P. nordicum (например, вяленое мясо и сыры), может быть альтернативным решением для контроля роста грибков и продукции OTA.

Ключевые слова: Lactobacillus buchneri; Lactobacillus plantarum; ОТА; Penicillium nordicum; уксусная кислота; гидроксифенилмолочная кислота; индол-молочная кислота; молочная кислота; фенилмолочная кислота.

Противогрибковые и антибактериальные эффекты вновь созданных ассоциаций молочнокислых бактерий в зависимости от среды культивирования и продолжительности культивирования | BMC Microbiology

Объекты исследования

В качестве объектов исследования использовались различные штаммы LAB, выделенные из традиционного армянского молочного продукта мацуна, сыров и желудочно-кишечного тракта медоносных пчел: Lactobacillus rhamnosus R-2002 (инвентарный номер KY054594 и передана в GenBank) депонирована в Микробиологическом депозитарном центре (MDC) (WDM803) (Научно-производственный центр «Армбиотехнология» Национальной академии наук Армении, Ереван, Армения) под номером MDC 9661, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (RIN-2003-Ls) , L. delbrueckii subsp. lactis INRA-2010-4.2 и L. delbrueckii subsp. bulgaricus INRA-2010-5.2 под кодовыми номерами MDC 9632 и MDC 9633 соответственно [18] , Enterococcus faecium INR-2010-Tsov-G-St, Streptococcus thermophilus ВКПМ B-3809 , Enterococcus durans (Ред — предоставлено Национальным институтом агрономии исследований, Нант, Франция, INRA), Lactobacillus spp.(B7 — выделен от пчел).

Создание ассоциаций LAB

Все ассоциации были созданы в соответствии с методом, описанным Матевосяном и др. [20]. Штаммы LAB культивировали в модифицированном бульоне MRS (10 г л — 1 мясного экстракта, 10 г L — 1 полипептона, 5 г L — 1 экстракта дрожжей, 20 г L — 1 глюкозы, 2 г л -1 цитрата аммония, 0,2 г л -1 MgSO 4 , 0,05 г л -1 MnSO 4 , 1 г л -1 Твин 80, 0.8% агар, стерилизация при 1 атм., 15 мин) при 37 ° С в течение 24 ч. С этой же целью использовалось 10% молоко (сухое молоко производства ООО «Катнарат», Армения) [21].

Определение противогрибковой активности

Для определения противогрибковой активности были отобраны шесть наиболее активных штаммов LAB, из которых были созданы 15 различных комбинаций согласно Bazukyan et al. [19] и Матевосян и др. [20]. Противогрибковая активность E. durans не изучалась, поскольку это референсный штамм из INRA (Нант, Франция), противогрибковая активность которого была показана Ахмадовой и соавт.[22]. Штамм B7 не был включен в создание ассоциаций, так как не был активен. Противогрибковые свойства ассоциаций LAB определяли как методом хорошо-диффузии, так и полной диффузией в агар. Следует отметить, что все эксперименты проводились с использованием среды mod MRS, поскольку она подходит как для роста грибков (плесени), так и для роста LAB. В качестве тест-организмов использовались различные виды плесневых грибов и дрожжей: Mucor plumbeus , Geotrichum Candidum, Fusarium oxysporum , Cladosporium herbarum (выделено из испорченной пищи и предоставлено лабораторией взаимодействия биополимеров, функции и взаимодействия белков (FIPL) ), INRA) [22], Aspergillus flavus, Penicillium aurantioviolaceum, Penicillium spp.и Trichoderma viride (выделено из испорченной пищи и предоставлено доктором К. Григоряном, Ереванский государственный университет, Ереван, Армения), Candida albicans 301 (выделено из клинического материала), Debaryomyces hansenii. Метод хорошо-диффузии проводили по методу, описанному в [23], с использованием в качестве среды культивирования Сабуро с 0,9% масс. По — 1 агара. 50 мкл каждой культуральной жидкости LAB (LAB выращивали в модифицированном бульоне MRS при 37 ° C в течение 24 часов) добавляли в лунки (2 разных штамма LAB смешивали в равных пропорциях).Наличие противогрибковой активности определяли по отсутствию роста грибков / дрожжей вокруг лунки (качественный тест). Используя диффузию в агар, 250 мкл каждой ночной LAB (2 различных штамма LAB были смешаны в равных пропорциях) культуральной жидкости добавляли в небольшие (7 мл) чашки Петри и покрывали модифицированным агаром MRS. Суспензию спор грибка / плесени (количество 10 4 на мл) по каплям наносили на поверхность среды после 48 ч культивирования LAB. Суспензии спор грибов готовили по Базукяну и соавт.[19]. Противогрибковая активность определялась при отсутствии роста грибков / плесени на поверхности среды (количественный тест). Антибактериальная и противогрибковая активность смесей LAB сравнивали с результатами исходных штаммов.

Определение антибактериальной активности

Семь штаммов LAB были отобраны в соответствии с высокой антибактериальной активностью, которая была изучена ранее [14, 18]. Штамм E. faecium INR-2010-Tsov-G-St не проявил антибактериальной активности, поэтому в комбинации не входил.

Определена антибактериальная активность 21 различных ассоциаций LAB. Антибактериальные свойства смешанных культур LAB изучали как в модифицированном MRS-бульоне, так и в молоке двумя способами культивирования (одновременное культивирование штаммов LAB и культивирование этих штаммов, разделенных по времени при 37 ° C) методом диффузии в лунках агара [20, 23] . Для определения антибактериальной активности использовали разных грамположительных и грамотрицательных представителей разных родов: Staphylococcus aureus MDC 5233 (MDC, Армения), Bacillus mesentericus WT, B.subtilis WT-A1 (выделено из пробы почвы) и Micrococcus luteus WT (выделено из пробы воздуха), Escherichia coli ВКПМ-М17 (Российская национальная коллекция промышленных микроорганизмов, Институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, Россия), Salmonella typhimurium MDC 1759 и Pseudomonas aeruginosa WT272786 (выделено из клинического материала и предоставлено ООО «Пром-Тест», Ереван, Армения). В лунку добавляли 100 мкл смесей.Распространение антибактериальных веществ происходило в течение 30 мин при комнатной температуре. Диаметр зон задержки роста тест-организмов измеряли через 24 ч. В качестве положительного результата, диаметром не менее 2 мм, была обнаружена чистая зона ингибирования, как положительный результат.

Одновременное культивирование проводили путем смешивания каждых 2 отдельных штаммов LAB (0,5%) в одной питательной среде (модифицированный бульон MRS) и культивирования вместе при 37 ° C в течение 24 часов. КОЕ каждого исходного штамма LAB доводили до 10 8 перед смешиванием.В этих экспериментах также использовался метод диффузии в лунках агара, описанный выше. Второй способ — разнесенное по времени культивирование штаммов LAB (штаммы имеют разную продолжительность культивирования). Сначала первый штамм LAB культивировали в моде MRS (или молоке) в течение 24 ч при 37 ° C, а затем смешивали со вторым штаммом и снова культивировали в тех же условиях. Итак, первый штамм LAB культивировали в течение 48 ч, а второй штамм — в течение 24 ч. Затем места деформаций поменяли.В каждом случае антибактериальную активность ассоциаций сравнивали с такой же активностью чистых культур LAB.

Обработка данных

Все данные представляют собой средние значения трех независимых экспериментов. Стандартные ошибки были определены с помощью программного обеспечения Excel 2013.

Противогрибковые метаболиты лактобацилл | Treesearch

Противогрибковые метаболиты лактобацилл | Treesearch Перейти к основному содержанию

.gov означает, что это официально.
Веб-сайты федерального правительства часто заканчиваются на .gov или .mil. Прежде чем делиться конфиденциальной информацией, убедитесь, что вы находитесь на сайте федерального правительства.

Сайт безопасен.
https: // гарантирует, что вы подключаетесь к официальному веб-сайту, а любая предоставляемая вами информация шифруется и безопасно передается.

Тип публикации:

Разные публикации

Первичная станция (и):

Лаборатория лесных товаров

Источник:

Материалы конференции по долговечности деревянных каркасных домов и проблемам стихийных бедствий, 4-6 октября 2004 г… Лас-Вегас, Невада, США. Мэдисон, Висконсин: Общество лесных товаров, [2004]: стр. 307-311.

Описание

В последние годы в США резко возросло беспокойство общественности по поводу роста плесени в помещениях. В этом исследовании были оценены молочнокислые бактерии, которые, как известно, продуцируют антимикробные соединения, важные для биосохранения пищевых продуктов, с целью определить, можно ли использовать те же антимикробные свойства для защиты древесины от образования плесени.На основании измерения биомассы бесклеточные супернатанты Lactobacillus casei subsp. rhamnosus и Lactobacillus acidophilus, выращенные в бульоне deMan Rofosa Sharpe (MRS), подавляли от 95 до 100 процентов рост трех видов плесени и одного грибка-красителя, связанного с деревянными строительными материалами. Молочную кислоту и четыре неизвестных соединения с молекулярной массой £ 1 кДа фракционировали из культурального супернатанта с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Противогрибковая активность, которая была приписана одному или нескольким неизвестным метаболитам, сохранялась во время нагревания и нейтрализации.Разведение 1: 2 супернатанта L. casei подавляло 100% рост всех тестируемых грибов.

Цитата

Ян, Вина А .; Клаузен, Кэрол А. 2004. Противогрибковые метаболиты лактобацилл. Материалы конференции по долговечности деревянных каркасных домов и проблемам стихийных бедствий, 4-6 октября 2004 г. … Лас-Вегас, Невада, США. Мэдисон, Висконсин: Общество лесных товаров, [2004]: стр. 307-311.

Примечания к публикации

  • Мы рекомендуем вам также распечатать эту страницу и прикрепить ее к распечатке статьи, чтобы сохранить полную информацию о цитировании.
  • Эта статья была написана и подготовлена ​​служащими правительства США в официальное время и поэтому находится в открытом доступе.

https://www.fs.usda.gov/treesearch/pubs/21594

Широкое и комплексное противогрибковое действие среди экологических изолятов молочнокислых бактерий | Письма о микробиологии FEMS

997″ data-legacy-id=»ss1″> 1 Введение

Плесень и дрожжи, портящие продукты питания и корма, приводят к большим экономическим потерям во всем мире. Кроме того, наличие плесени с сопутствующим образованием аллергенных спор и, возможно, микотоксинов делает их серьезной потенциальной опасностью для здоровья [1]. Таким образом, снижение роста плесени и дрожжей при производстве и хранении пищевых продуктов и кормов имеет первостепенное значение, и существует большой интерес к разработке эффективных и безопасных стратегий для этой цели.В этом контексте в последние годы большое внимание уделяется применению биоконсервации, то есть контроля над одним организмом другим. Известно, что молочнокислые бактерии (LAB) продуцируют различные противомикробные соединения и играют важную роль в биоконсервации пищевых продуктов и кормов [2–4]. LAB представляют особый интерес как организмы для биоконсервации, поскольку они давно используются в пищевых продуктах и ​​«в целом считаются безопасными» организмами. Их консервирующий эффект в основном связан с производством органических кислот, т.е.е. молочная и уксусная кислоты [5], но бактериоцины, продуцируемые некоторыми штаммами, также имеют значение [6].

Большинство большого количества сообщений об антимикробной активности LAB сосредоточено на антибактериальных эффектах [6], в то время как сообщений о противогрибковых эффектах немного. Lavermicocca et al. [3] сообщили о производстве противогрибковых соединений фениллмолочной кислоты и 4-гидроксифенилмолочной кислоты штаммом закваски Lactobacillus plantarum . Кроме того, бактериоциноподобные вещества и другие низкомолекулярные соединения, продуцируемые LAB, считаются противогрибковыми [7,8].Наша группа недавно обнаружила, что штамм Lactobacillus coryniformis Si3 может продуцировать белковое противогрибковое соединение [9]. Мы также идентифицировали противогрибковые циклические дипептиды из силоса штамма L. plantarum [10].

В этом исследовании были определены идентичность и спектры ингибирования грибков 42 изолятов LAB. Большинство изолятов было получено из растительного материала, но некоторые изоляты были собраны из кишечника цыплят, меда и почвы.Изоляты подвергали скринингу против пяти видов плесневых грибов: Aspergillus fumigatus , Aspergillus nidulans , Penicillium commune , Penicillium roqueforti и Fusarium sporotrichioides и mucilomdala mucilomdala mucilhostsala mucilhoasts. Kluyveromyces marxianus . Эти грибы были выбраны как организмы, вызывающие порчу, имеющие экономическое значение при работе с пищевыми продуктами и кормами [1].

Было проведено фракционирование фильтрата культуры из пяти изолятов для выяснения природы продуцируемых соединений. Степень подавления грибков была связана не только с производством молочной или уксусной кислоты, но с комбинацией различных соединений. Можно сделать вывод, что LAB продуцируют широкий спектр соединений, которые могут действовать синергетически в отношении мицелиальных грибов и дрожжей.

003″ data-legacy-id=»ss2-1″> 2.1 Выделение молочнокислых бактерий

Изолятов

LAB были собраны из различных природных сред, но большинство из них были выделены из растительного материала (листьев, стеблей и цветов) после обогащения в мини-силосах в анаэробных условиях.Остальные изоляты были получены из почвы, меда, кишечника цыпленка и свиньи. Штамм Si3 L. coryniformis , ранее выделенный из травяного силоса [9], также был включен в исследование. Растительный материал ферментировали при 10, 25 или 30 ° C в течение 10 дней в 50-миллилитровых мини-бункерах, снабженных иглой шприца для снятия избыточного давления из произведенного CO 2 . После инкубации 10 г растительного материала суспендировали в 90 мл стерильной пептонной воды (0,2% мас. / Об.) И обрабатывали в течение 2 мин в стоматологическом аппарате. Для образцов почвы порции по 10 г почвы суспендировали в 90 мл стерильной пептонной воды (0.2% мас. / Об.). Смесь встряхивали в течение 15 мин на роторном шейкере при 120 об / мин. Кишечник только что убитых животных собирали на бойне. В лаборатории кишечник был разрезан, разрезан и промыт ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления неплотно связанного кишечного содержимого. Затем материал слизистой оболочки был освобожден, осторожно соскребая кишечник шпателем. Освободившийся материал собирали в пробирки с ледяным PBS. Для всех вышеуказанных выделений разведения были выполнены стерильной пептонной водой (0.2% мас. / Об.), Наносили на чашки с агаром MRS (Oxoid) и инкубировали в анаэробных сосудах в атмосфере CO 2 + N 2 (GasPak System, BBL) в течение 7 дней при 10 ° C, 3 дня при 25 ° C, 2 дня при 30 ° C или 2 дня при 37 ° C (кишечные изоляты). После инкубации колонии переносили в новые чашки MRS и инкубировали второй раз. Рабочие культуры содержали в анаэробных условиях на чашках с агаром MRS при 5 ° C. Длительное хранение штаммов проводили либо при -70 ° C в 15% растворе соли глицерина (0.82 г K 2 HPO 4 , 0,18 г KH 2 PO 4 , 0,59 г цитрата натрия, 0,25 г MgSO 4 · 7H 2 O на литр) или лиофилизированный в сухом обезжиренном молоке.

007″ data-legacy-id=»ss2-3″> 2.3 Противогрибковые тесты

LAB были проверены на противогрибковую активность с использованием метода наложения двух культур [9]. Бактерии высевали двумя линиями по 2 см на чашки с агаром MRS и позволяли расти при 30 ° C в течение 48 ч в анаэробных сосудах.Затем чашки покрывали 10 мл мягкого агара с солодовым экстрактом (0,05% солодового экстракта; Difco Laboratories и 1% агар; Oxoid), содержащего 10 4 дрожжевых клеток или спор плесени (конидий) на мл. Через 48 ч аэробной инкубации при 30 ° C измеряли зону ингибирования. Ингибирование оценивали путем соотнесения площади ингибированного роста на полосу посева с общей площадью чашки Петри. Зона ингибирования также была связана с изменением длины бактериальной полоски. Использовалась следующая шкала: — — отсутствие видимого торможения; +, на 0 нет грибкового роста.1–3% площади пластины / бактериальная полоса; ++, грибок отсутствует на 3–8% площади пластины / бактериальной полосе; +++, грибок отсутствует на> 8% площади пластины / бактериальной полосы. Тесты на ингибирование проводили в двух экземплярах.

Определение противогрибковой активности выделенных соединений проводили в двух экземплярах с использованием метода лунок микротитрационного планшета с A. fumigatus в качестве организма-мишени [9]. В методе лунок микротитрационного планшета 50 мкл бульона MRS (Oxoid), содержащего 10 4 спор грибов на мл, добавляли в каждую лунку.Высушенные на воздухе фракции фракционирования с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) растворяли в 50 мкл 10 мМ HAc, оставляли при комнатной температуре на 3 часа, а затем переносили в соответствующие лунки в микротитровальном планшете. После 48 ч инкубации при 30 ° C ингибирование детектировали путем измерения оптической плотности (OD) при 550 нм с помощью автоматического считывающего устройства для микропланшетов. Инвертированный микроскоп и измерения невооруженным глазом также использовались для оценки роста грибков в лунках.

012″ data-legacy-id=»ss2-5″> 2.5 Идентификация молочнокислых бактерий

Морфологию клеток наблюдали с помощью световой микроскопии.Все штаммы были идентифицированы анализом последовательности 16S рДНК. Бактериальную ДНК выделяли из бактерий, выращенных в бульоне MRS, с использованием набора DNeasy ™ Tissue Kit (Qiagen). 16S рДНК амплифицировали с помощью ПЦР (94 ° C в течение 30 секунд, 54 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 80 секунд, 30 циклов) с использованием праймеров 16S.S (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3 ‘) и 16S.R ( 5’-CGGGAACGTATTCACCG-3 ‘). Полученный продукт ПЦР очищали с использованием набора для очистки ПЦР Qiagen. Обе цепи очищенного фрагмента частично секвенировали с использованием предварительной смеси для секвенирования цикла термо-секвеназы с красителем (Amersham Biosciences) и автоматического анализатора последовательностей ABI Prism 377XL (Perkin Elmer).Для секвенирования использовали праймеры 16S.S и дополнительный внутренний праймер 16S4 (5’-CCYACTGCTGCCTCCCGT-3 ‘). Неполные последовательности 16S рДНК, приблизительно 450 п.н., кодирующие вариабельные области V1 и V2, были использованы для поиска в общедоступных базах данных (GenBank®).

016″ data-legacy-id=»ss2-7″> 2.7 Приготовление бесклеточного супернатанта

штаммов MiLAB 006, 016, 024 и 091 и штамм Si3 инокулировали в 10 5 клеток на мл -1 в 200 мл бульона MRS и инкубировали в виде неподвижных культур при 30 ° C в течение 48 часов.Бесклеточный супернатант получали центрифугированием (7000 об / мин в течение 15 мин) и стерильной фильтрацией (0,45 мкм, Millipore). Фильтрат бесклеточной культуры использовали для дальнейшего выделения противогрибковых соединений.

021″ data-legacy-id=»ss3″> 3 Результаты

024″ data-legacy-id=»ss3-2″> 3.2 Подавление плесени и дрожжей

Различные степени ингибирования были обнаружены против плесени P. commune , A. fumigatus , A. nidulans и F. sporotrichioides . Последний, который был наиболее чувствительным индикаторным штаммом, подавлялся (++ или +++) всеми штаммами бактерий.Ни один из изолятов не проявил активности против P. roqueforti . Среди дрожжей только R. mucilaginosa ингибировались некоторыми изолятами (таблица 1). Примечательно, что некоторые изоляты проявляли более низкий ингибирующий эффект при определении противогрибковых спектров, чем при первичном скрининге.

1

Источник выделения, видовая принадлежность и спектры грибкового ингибирования штаммов LAB

+++ Pentos 90 351 Si3 351 — +++ Кишечник цыпленка 352 + + plantarum 90 — + 9 0351 Lactobacillus coryniformis Enteroccus — 9 0351-352 90cus375 PediLAB 022 pentosaceus 90 351 +++ Mi 903 51 ++ Одуванчик 9035oc1 9035oc1
Штамм Виды Начальная активность J9 J283 J304 J238

007″ data-legacy-id=»ss2-3″> J238 J238 J350 Источник
MiLAB 006 Lactobacillus plantarum +++ ++ ++ ++ — ++ — ++ — ++ — Сиреневые цветы
MiLAB 014 Lactobacillus plantarum +++ +++ + +++ ++ — + Сиреневые цветы
MiLAB 016 Pediococcus pentosaceus +++ ++ + +++ ++ Цветки каштана
Pedoci 018 +++ ++ ++ +++ ++ ++ Цветы каштана
MiLAB 022163352 9035oc +++ ++ ++ +++ + Clover
Ручка MiLAB 024 MiLAB 024 ++ +++ ++ +++ ++ Клевер
Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ (+) ++ ++ ++
MiLAB 029 Pediococcus pentosaceus +++ ++ ++ +++ + MiLAB 031 Pediococcus pentosaceus +++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ MiLAB 037 Lactobacillus plantarum +++ ++ + +++ ++ Цветок одуванчика
MiLAB 039 Lactobacillus plantarum +++ ++ ++ +++ ++ Цветок одуванчика
MiLAB 047 Pediococcus pentosaceus +++ ++ + +++ + ++ Клевер
MiLAB 049 Lactobacillus acidophilus +++ +++
MiLAB 051 Lactobacillus salivarius +++ + ++ +++ ++ ++ Кишечник цыпленка
MiLAB 052 Lactobacillus salivarius +++ ++ Куриный кишечник
MiLAB 091 Lactobacillus sakei +++ +++ +++ ++ Одуванчик
MiLAB 099 Pediococcus parvulus +++ ++ ++ ++ Одуванчик
MiLAB 101 Pediococcus pentosaceus 90 352 +++ + + +++ +++ Одуванчик
MiLAB 120 52 +++ ++ + +++ ++ ++ Одуванчик
MiLAB 123 Lactobacillus ++ + + +++ + ++ Одуванчик
MiLAB 125 Lactobacillus + ++ +++ ++ ++ Одуванчик
MiLAB 148 Lactobacillus sakei ++ ++ + +++ + + Pediococcus pentosaceus +++ ++ + +++ + ++ AB Pediococcus pentosaceus ++ ++ ++ +++ ++ ++
++ +++ + +++ ++ +++ Цветок каштана
MiLAB 262 Lactobacillus plantarum ++ +++ + +++ ++ Цветок каштана
MiLAB 274 Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ +++ Цветок мать-и-мачехи
MiLAB 275 Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ — ++ — ++ Цветок мать-и-мачехи
MiLAB 282 Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ +++ Цветок гепатика
MiLAB 283 Lactobacillus +++ Lactobacillus +++ ++ +++ + Hepatica flower
MiLAB 290 Lactobacillus Lactobacillus 9035 + + +++ ++ ++ Листья рябины
MiLAB 291 Lactobacillus +++ ++ ++ +++ ++ ++ Листья рябины
MiLAB 303 ++ +++ ++ +++ + ++ Lactobacillus coryniformis ++ +++ ++ +++ ++ ++ Цветок одуванчика Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ 357 Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ ++ Цветок одуванчика
MiLAB 359 Lactobacillus coryniformis ++ +++ ++ +++ +++ ++ Стебель одуванчика
+ + ++ + Трава
MiLAB 026 ++ Цветок одуванчика
MiLAB 062 Lactobacillus salivarius + + +++ ++ — Кишечник куриный
MiLAB 268 Weissella soli + + ++ 069 Enterococcus durans + ++ Начальная активность J9 J283 J304 J238 J268 J121 J186 J350 Источник
MiLAB 006 Lactobacillus plantarum +++ Сиреневые цветы
MiLAB 014 Lactobacillus plantarum +++ +++ +++ + Сиреневые цветы
MiLAB 016 Pediococcus pentosaceus +++ ++ ++ ++ Цветки каштана
MiLAB 018 Pediococcus pentosaceus 901 64 +++ ++ ++ +++ ++ ++ Цветки каштана
Pedioc1 022 +++ ++ ++ +++ + Клевер
Клевер
MiLAB 24 Pedoc ++ +++ ++ +++ ++ Клевер
Si3 +++ +++ ++ +++ ++ (+) ++ Трава
MiLAB 029 Pediococcus pentosaceus +++ ++ ++ +++ + + Pediococcus pentosaceus +++ ++ ++ +++ ++ ++ Клевер Lactobacillus plantarum +++ ++ + +++ ++ Цветок одуванчика Lactobacillus plantarum +++ ++ ++ +++ ++ +++ Цветок одуванчика
MiLAB 047 Pediococcus pentosaceus +++ ++ + +++ + ++ Клевер
MiLAB 049 Lactobacillus acidophilus +++ +++ Кишечник цыпленка
MiLAB 051 Lactobacillus salivarius +++ + ++ +++ ++ Кишечник цыпленка
MiLAB 052 Lactobacillus salivarius +++ + ++ ++ Куриный кишечник
MiLAB 091 Lactobacillus sakei ++351 ++351 ++351 ++35 +++ ++ Одуванчик
MiLAB 099 Pediococcus parvulus +++ + + Одуванчик
MiLAB 101 Pediococcus pentosaceus +++ +++ ++ Одуванчик
MiLAB 120 Lactobacillus coryniformis 9 0352 +++ ++ + +++ ++ ++ Одуванчик
MiLAB 123 MiLAB 123 +++ + + +++ + ++ Одуванчик
MiLABis 125 9016iform + + ++ +++ ++ ++ Одуванчик
MiLAB 148 Lactob ++ + +++ + + Листья одуванчика
MiLAB 166 Pediococcus pentosaceus +++ ++ + +++ + ++ Grass 5 Mi 5 Pediococcus pentosaceus ++ ++ ++ +++ ++ ++ Lactobacillus plantarum ++ +++ + +++ ++ +++
Lactobacillus plantarum ++ +++ + +++ ++ Цветок каштана
MiLAB 274 Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ +++ Цветок мать-и-мачехи
MiLAB 275 Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ Цветок мать-и-мачехи
MiLAB 282 Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ Цветок Hepatica
MiLAB 283 Lactobacillus coryniformis +++ +++ 90 352 ++ +++ + Цветок гепатита
MiLAB 290 Lactobacillus +++ + +++ ++ ++ Листья рябины
MiLAB 291 Lactobacillus + + + ++ +++ ++ ++ Листья рябины
MiLAB 303 Lactobacillus ++ Coryn ++ ++ +++ + ++ Цветок мать-и-мачехи
MiLAB 311 Lactobacillus coryniformis ++ +++ ++ +++ ++ ++ 355 Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ + цветок одуванчика MiLAB 357 Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ ++
MiLAB 359 Lactobacillus coryniformis ++ +++ ++ +++ ++ ++ Стебель одуванчика
+ + ++ + Трава
MiLAB 026 MiLAB 026 ++ Цветок одуванчика
MiLAB 062 Lactobacillus ++ + ++ Куриный кишечник
MiLAB 268 Weissella soli + + ++
MiLAB 069 Enterococcus durans + ++ — Мед выделение, видовая принадлежность и спектры грибкового ингибирования штаммов LAB

Источник AB AB 16 Цветки каштана pentosaceus 9035 1 Цветки каштана ( ++ — ++ +++ 9 0351 Lactobacillus sakei 9035 1 MiLAB 290  90 351 − 
Штамм Виды Начальная активность J9 J283 J304 J238 J268 J268 J268
MiLAB 006 Lact obacillus plantarum +++ ++ ++ +++ ++ Сиреневые цветы
Lactobacillus plantarum +++ +++ + +++ ++ + Сиреневые цветы
Pediococcus pentosaceus +++ ++ + +++ ++ Цветки каштана
+++ ++ ++ +++ ++ ++
MiLAB 022 Pediococcus pentosaceus +++ ++ ++ +++ + Клевер
MiLAB 024 Pediococcus pentosaceus ++ +++ ++ +++ ++
Si3 Lactobacillus coryniformis +++ +++ ++ +++ ++ Трава
MiLAB 029 Pediococcus pentosaceus +++ ++ ++ +++ + — 903 52 + Клевер
MiLAB 031 Pediococcus pentosaceus +++ ++ ++ ++351 ++351 ++351 ++ Клевер
MiLAB 037 Lactobacillus plantarum +++ ++ + ++35 Цветок одуванчика
MiLAB 039 Lactobacillus plantarum +++ ++ +++ +++ +++ +++ Цветок одуванчика
MiLAB 047 Pediococcus pentosaceus +++ ++ 9 0352 + +++ + ++ Клевер
MiLAB 049 Lactobacillus acido2 +++ Кишечник цыпленка
MiLAB 051 Lactobacillus salivarius ++ ++ Куриный кишечник
MiLAB 052 Lactobacillus salivarius ++35 + ++ 35 + +++ ++ Куриный кишечник
MiLAB 091 +++ ++ + +++ ++ Одуванчик Pediococcus parvulus   +++  ++  +++  −  −  −  −  Dandelion 
MiLAB 101  Pediococcus pentosaceus +++  +++  +++  −  −  −  −  Dandelion 
MiLAB 120  Lactobacillus coryniformis   +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Dande lion 
MiLAB 123  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  −  −  −  ++  Dandelion 
MiLAB 125  Lactobacillus coryniformis   +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Dandelion 
MiLAB 148  Lactobacillus sakei   ++  ++  +++  −  −  −  Dandelion leaves 
MiLAB 166  Pediococcus pentosaceus   +++  ++  +++  −  9035 2 −  −  ++  Grass 
MiLAB 170  Pediococcus pentosaceus   ++  ++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Grass 
MiLAB 248  Lactobacillus plantarum   ++  +++  +++  ++  −  −  −  +++  Chestnut flower 
MiLAB 262  Lactobacillus plantarum   ++  +++  +++  ++  −  −  −  ++  Chestnut flower 
MiLAB 274  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  90 352 ++  +++  ++  −  −  −  +++  Coltsfoot flower 
MiLAB 275  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Coltsfoot flower 
MiLAB 282  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  +++  Hepatica flower 
MiLAB 283  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  −  −  −  −  Hepatica flower 
Lactobacillus coryniformis   +++  +++  +++  ++  −  −  −  ++  Rowan leaves 
MiLAB 291  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Rowan leaves 
MiLAB 303  Lactobacillus coryniformis   ++  +++  ++  +++  −  −  −  ++  Coltsfoot flower 
MiLAB 311  Lactobacillus coryniformis   ++  +++  ++  +++  ++  −  −  ++  Dandelion flower 
MiLAB 355  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  Dandelion flower 
MiLAB 357  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Dandelion flower 
MiLAB 359  Lactobacillus coryniformis   ++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Dandelion stalk 
                       
MiLAB 199  Lactobacillus sakei   −  ++  −  −  −  −  Grass 
MiLAB 026  Enterococcus hirae   −  −  ++  −  −  −  −  −  Dandelion flower 
MiLAB 062  Lactobacillus salivarius   −  +++  ++  −  −  −  −  Chicken intestine 
MiLAB 268  Weissella soli   −  ++  −  −  −  −  Soil 
MiLAB 069  Enterococcus durans   −  −  ++  −  −  −  −  −  Honey 
90 351 −  9 0351 +++ 
Strain  Species  Initial activity  J9  J283  J304  J238  J268  J121  J186  J350  Source 
MiLAB 006  Lactobacillus plantarum   +++  ++  ++  +++  ++  −  −  −  −  Lilac flowers 
MiLAB 014  L actobacillus plantarum   +++  +++  +++  ++  −  −  −  Lilac flowers 
MiLAB 016  Pediococcus pentosaceus   +++  ++  +++  ++  −  −  −  −  Chestnut flowers 
MiLAB 018  Pediococcus pentosaceus   +++  ++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Chestnut flowers 
MiLAB 022  Pediococcus pentosaceus   +++  ++  ++  +++  −  −  −  −  Clover 
MiLAB 024  Pediococcus pentosaceus   ++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  −  Clover 
Si3  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  (+)  ++  Grass 
MiLAB 029  Pediococcus pentosaceus   +++  ++  ++  +++  −  −  −  Clover 
MiLAB 031  Pediococcus pentosaceus   +++  ++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Clover 
MiLAB 037  Lactobacillus plantarum   +++  ++  +++  ++  −  −  −  −  Dandelion flower 
MiLAB 039  Lactobacillus plantarum   +++  ++  ++  +++  ++  −  −  −  +++  Dandelion flower 
MiLAB 047  Pediococcus pentosaceus   +++  ++  +++  −  −  −  ++  Clover 
MiLAB 049  Lactobacillus acidophilus   +++  −  −  +++  −  −  −  −  −  Chicken intestine 
MiLAB 051  Lactobacillus salivarius   +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Chicken intestine 
MiLAB 052  Lactobacillus salivarius   +++  ++  +++  ++  −  −  −  −  Chicken intestine 
MiLAB 091  Lactobacillus sakei   +++  ++  +++  −  −  −  −  ++  Dandelion 
MiLAB 099  Pediococcus parvulus   +++  ++  +++  −  −  −  −  Dandelion 
MiLAB 101  Pediococcus pentosaceus   +++  +++  +++  −  −  −  −  Dandelion 
MiLAB 120  Lactobacillus coryniformis   +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Dandelion 
MiLAB 123  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  −  −  −  ++  Dande lion 
MiLAB 125  Lactobacillus coryniformis   +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Dandelion 
MiLAB 148  Lactobacillus sakei   ++  ++  +++  −  −  −  Dandelion leaves 
MiLAB 166  Pediococcus pentosaceus   +++  ++  +++  −  −  −  ++  Grass 
MiLAB 170  Pediococcus pentosaceus   ++  ++  ++  +++  ++  −  −  ++  Grass 
MiLAB 248  Lactobacillus plantarum   ++  +++  +++  ++  −  −  −  +++  Chestnut flower 
MiLAB 262  Lactobacillus plantarum   ++  +++  +++  ++  −  −  −  ++  Chestnut flower 
MiLAB 274  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  +++  Coltsfoot flower 
MiLAB 275  Lactobacillus coryniformis   +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Coltsfoot flower 
MiLAB 282  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  +++  Hepatica flower 
MiLAB 283  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  −  −  −  −  Hepatica flower 
MiLAB 290  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  +++  ++  −  −  −  ++  Rowan leaves 
MiLAB 291  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Rowan leaves 
MiLAB 303  Lactobacillus coryniformis   ++  +++  ++  +++  −  −  −  ++  Coltsfoot flower 
MiLAB 311  Lactobacillus coryniformis   ++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Dandelion flower 
MiLAB 355  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  Dandelion flower 
MiLAB 357  Lactobacillus coryniformis   +++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Dandelion flower 
MiLAB 359  Lactobacillus coryniformis   ++  +++  ++  +++  ++  −  −  −  ++  Dandelion stalk 
                       
MiLAB 199  Lactobacillus sakei   −  ++  −  −  −  −  Grass 
MiLAB 026  Enterococcus hirae   −  −  ++  −  −  −  −  −  Dandelion flower 
MiLAB 062  Lactobacillus salivarius   −  +++  ++  −  −  −  −  Chicken intestine 
MiLAB 268  Weissella soli   −  ++  −  −  −  −  Soil 
MiLAB 069  Enterococcus durans   −  −  ++  −  −  −  −  −  Honey 

3.3 Идентификация изолятов

Приблизительно 450 п.н. последовательности 16S рДНК были определены для 42 выбранных изолятов, включенных в это исследование. Последовательности, полученные из изолятов, использовали для поиска в базах данных наивысшего ранга сходства для определения видовой принадлежности изолятов (таблица 1). Большинство из 37 изолятов с высокой или умеренной активностью, т.е. 15 изолятов, были идентифицированы как L. coryniformis . Из оставшихся 10 изолятов были идентифицированы как Pediococcus pentosaceus , шесть — как L.plantarum , два как Lactobacillus sakei , два как Lactobacillus salivarius , один как Pediococcus parvulus и один как Lactobacillus acidophilus . Ни один из пяти изолятов с низкой активностью или без нее не принадлежал к трем основным противогрибковым видам, обнаруженным в этом исследовании.

3.4 Анализ молочной кислоты методом ВЭЖХ

Чтобы выяснить, были ли различия в подавлении плесени следствием изменений в продукции органических кислот, ВЭЖХ-анализ молочной и уксусной кислоты в культуральном супернатанте был проведен на изолятах одного и того же вида с высокой или низкой активностью.Сравнивались два штамма P. pentosaceus , MiLAB 024 (+++, ингибирование A. fumigatus J9) и MiLAB 101 (+), а также три штамма L. coryniformis , MiLAB 123 (+), MiLAB 283 (+++) и MiLAB 311 (+++) сравнивали (рис. 1). MiLAB 101 и MiLAB 123 первоначально показали высокую активность (+++), но потеряли большую часть этой активности во время хранения или обращения. Концентрация уксусной кислоты в образцах 29–31 мМ соответствует количеству, присутствующему в бульоне MRS. Самые высокие концентрации молочной кислоты, 90 и 95 мМ, наблюдались у двух изолятов с самой низкой противогрибковой активностью.Три изолята с высокой противогрибковой активностью продуцировали небольшое количество молочной кислоты (60, 62 и 62 мМ).

1

Активность двух разных изолятов L. coryniformis , MiLAB 123 (слева, +) и MiLAB 283 (справа, +++), после длительного хранения при -70 ° C против индикаторной плесени A. fumigatus . Оба изолята первоначально показали сильную (+++) активность против A. fumigatus .

1

Активность двух разных L.coryniformis , MiLAB 123 (слева, +) и MiLAB 283 (справа, +++) после длительного хранения при -70 ° C против индикаторной плесени A. fumigatus . Оба изолята первоначально показали сильную (+++) активность против A. fumigatus .

3.5 Выделение противогрибковых соединений

Противогрибковая активность бесклеточных супернатантов, полученных в результате роста штаммов MiLAB 006, 016, 024 и 091, и штамма Si3 в бульоне MRS, была восстановлена ​​как в гидрофильной, так и в 95% ацетонитрильной (гидрофобной) фазе после SPE на C 18 столбец, указывающий на сложную природу противогрибкового соединения или соединений.Дальнейшее фракционирование гидрофобной фазы с помощью ВЭЖХ с использованием колонки C 18 и анализ сопутствующей активности в микротитровальных лунках выявили различные паттерны противогрибкового ингибирования для пяти изолятов против A. fumigatus (рис. 2). Никакой активности не наблюдали в соответствующих фракциях из незасеянного бульона MRS.

2

Распределение противогрибкового действия штаммов MiLAB 006, 016, 024, 091, 393 и штамма Si3 после частичной очистки.Противогрибковый эффект регистрируется как полное ингибирование (черные кружки), частичное противогрибковое действие (серые кружки) или отсутствие ингибирования (белые кружки). При характеристике фракций из штаммов Si3 и MiLAB 393 циклический дипептид цикло (Phe-4-OH-Pro) обнаруживается во фракциях C10 – C12, цикло (Phe-Pro) и фенилмолочная кислота во фракциях D9 – D12, а молочная кислота во фракциях. B10 – B12. Остальные лунки с противогрибковой активностью содержат неизвестные вещества. Стрелки указывают движение коллектора фракций.

2

Распределение противогрибкового действия штаммов MiLAB 006, 016, 024, 091, 393 и штамма Si3 после частичной очистки.Противогрибковый эффект регистрируется как полное ингибирование (черные кружки), частичное противогрибковое действие (серые кружки) или отсутствие ингибирования (белые кружки). При характеристике фракций из штаммов Si3 и MiLAB 393 циклический дипептид цикло (Phe-4-OH-Pro) обнаруживается во фракциях C10 – C12, цикло (Phe-Pro) и фенилмолочная кислота во фракциях D9 – D12, а молочная кислота во фракциях. B10 – B12. Остальные лунки с противогрибковой активностью содержат неизвестные вещества. Стрелки указывают движение коллектора фракций.

Были выяснены структуры активных соединений, продуцируемых штаммом Si3, соответствующие фракциям, полученным на стадии очистки ВЭЖХ.После ЯМР и МС было определено, что активные соединения были цикло (Phe-Pro), элюировавшимся в лунках C10 – C11, и цикло (Phe-4-OH-Pro) и фенилмолочной кислотой, оба соединения элюировались в лунке D10.

4 Обсуждение

Дрожжи и плесень — обычные организмы, вызывающие порчу продуктов питания и кормов. Дрожжи, включенные в это исследование, такие как R. mucilaginosa и K. marxianus , являются важными микроорганизмами, вызывающими порчу молочных продуктов, таких как йогурт, сливки и сыр [1].Такие плесени, как P. roqueforti и P. commune , обычно портят твердый сыр, а различные виды Fusarium связаны с зерном пшеницы и ржи и могут продуцировать микотоксины в зернах злаков [11]. Таким образом, существует определенная потребность в безопасных и эффективных способах предотвращения роста грибков в сырье и пищевых продуктах. LAB давно используются в качестве консервантов в пищевых продуктах и ​​кормах и считаются безопасными для использования организмами. Противомикробные вещества из LAB в некоторых случаях хорошо изучены, особенно в отношении антибактериального эффекта в нескольких формах.Однако сообщений о противогрибковой активности LAB относительно немного. Недавно мы описали L. coryniformis subsp. coryniformis штамм Si3 с широким спектром ингибирования против плесени и дрожжей [9]. В настоящем исследовании мы идентифицировали 36 новых изолятов с сильной или умеренной противогрибковой активностью на уровне вида. Среди них 14 принадлежали к тому же виду, что и штамм Si3, L. coryniformis . Большинство из 15 изолятов L. coryniformis , включая Si3, были ингибирующими в отношении широкого круга грибов.Помимо нашей предыдущей публикации, мы не нашли никаких литературных сообщений об антимикробной активности L. coryniformis . Таким образом, при отборе видов бактерий, которые были идентифицированы как противогрибковые в ходе нашего скрининга, наблюдается поразительная предвзятость. По нашим данным, нельзя сделать вывод о том, является ли это результатом самой процедуры скрининга, или это можно объяснить тем фактом, что L. coryniformis , L. plantarum и P. pentosaceus чаще являются антагонистами по отношению к грибам.Примечательно, однако, что из кишечных изолятов цыплят мы смогли идентифицировать два штамма L. salivarius с высокой активностью.

В данном исследовании изоляты LAB были отобраны в первую очередь за их способность подавлять плесень A. fumigatus . Среди этих 37 изолятов с сильной ингибирующей активностью и пять изолятов с нулевой или низкой активностью были выбраны для дальнейшего исследования. Однако при определении спектров ингибирования грибков только 29 из 37 изолятов сохранили свою первоначальную высокую активность.Кроме того, все изоляты, происходящие из кишечника цыплят, включенные в это исследование, утратили свою активность во время хранения и обращения. Несколько изолятов, утративших активность, принадлежат к тому же виду, что и изоляты со стабильной сильной ингибирующей активностью. Причина потери активности неизвестна. Однако в нашей предыдущей работе мы столкнулись с аналогичными проблемами, касающимися производства и стабильности активных противогрибковых соединений [9].

Cabo et al. [12] недавно предположили, что противогрибковая активность LAB обусловлена ​​синергическим эффектом молочной кислоты, продуцируемой бактериями, и уксусной кислоты из ростовой среды MRS.Чтобы исключить возможность того, что наблюдаемые различия в противогрибковой активности в нашем исследовании были вызваны различной степенью продукции органических кислот, мы выполнили анализ бактериальных супернатантов методом ВЭЖХ. Продукция молочной кислоты была такой же или даже выше у тестированных отрицательных изолятов. Концентрация уксусной кислоты соответствовала количеству, обнаруженному в бульоне MRS. Таким образом, анализ ВЭЖХ молочной и уксусной кислоты в культуральном супернатанте этих штаммов не дал объяснения разной степени ингибирования грибов в анализе с двойной культурой на агаре.Эта активность, вероятно, будет вызвана производством других противогрибковых соединений.

Ström et al. [10] обнаружили, что L. plantarum MiLAB 393 продуцировал три противогрибковых вещества: цикло ( L -Phe- L -Pro), цикло ( L -Phe- транс -4-OH- L -Pro) и фенилмолочной кислоты. В этом исследовании цикло (Phe-Pro), цикло (Phe-4-OH-Pro) и фенилмолочная кислота были идентифицированы из супернатанта штамма L. coryniformis Si3.Хотя полная стереохимия не была выяснена, соединения из L. coryniformis Si3, по-видимому, очень похожи на соединения из L. plantarum MiLAB 393. Используемый метод выделения ВЭЖХ был воспроизводимым, т.е. циклические дипептиды всегда присутствовали в определенных фракциях. Таким образом, вероятно, что эти вещества, о которых ранее сообщалось только от штаммов L. plantarum [3,10], также продуцируются P. pentosaceus (MiLAB 024), L.sakei (MiLAB 091) и еще один L. plantarum (MiLAB 006).

Это указывает на то, что некоторые противогрибковые соединения широко распространены среди различных видов LAB. Помимо активности, обнаруженной во фракциях, упомянутых выше, существует несколько других фракций с противогрибковой активностью. Эти фракции, содержащие возможно неизвестные противогрибковые вещества, в настоящее время исследуются.

Текущее исследование показывает, что LAB из разных сред и из разных родов и видов может проявлять противогрибковую активность против ряда распространенных плесневых грибов и дрожжей.Ингибирующая активность вызывается несколькими различными соединениями. Дальнейшие исследования природы ингибирующих соединений и механизма их действия вместе с разработкой подходящих областей применения могут иметь большой потенциал для борьбы с грибами, вызывающими порчу.

Благодарности

Это исследование финансировалось MISTRA (Шведский фонд стратегических исследований окружающей среды) и SLF (Фонд шведских фермеров для сельскохозяйственных исследований).Мы благодарим доктора Ханса Йонссона за ценные предложения по улучшению рукописи.

Список литературы

[1]

(

1999

)

Грибки и порча пищевых продуктов

.

Chapman and Hall

,

New York

. [2]

(

2002

)

Ингибирующие вещества, продуцируемые лактобациллами, выделенными из закваски — обзор

.

Внутр. J. Food Microbiol.

72

,

31

43

.[3]

(

2000

)

Очистка и характеристика новых противогрибковых соединений из закваски Lactobacillus plantarum штамм 21B

.

заявл. Environ. Microbiol.

66

,

4084

4090

. [4]

(

1990

)

Антагонистическая активность молочнокислых бактерий при ферментации пищевых продуктов и кормов

.

FEMS Microbiol.Ред.

87

,

149

164

. [5]

(

1996

)

Биоконсервация с помощью молочнокислых бактерий

.

Антони ван Левенгук

70

,

331

345

. [6]

(

1994

)

Бактериоцины молочнокислых бактерий

. В:

Genetics and Biotechnology of Lactic Bacteria

(, Eds.), Pp.

211

251

.

Blackie Academic and Professional

,

Лондон

. [7]

(

1999

)

Новые типы антимикробных препаратов, производимые Lactobacillus plantarum

.

J. Appl. Microbiol.

86

,

29

35

. [8]

(

1999

)

Характеристика пентоцина TV35b, бактериоциноподобного пептида, выделенного из Lactobacillus pentosus с фунгистатическим действием на Candida albicans

.

J. Appl. Microbiol.

87

,

726

734

. [9]

(

2001

)

Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis штамм Si3 продуцирует белковое противогрибковое соединение широкого спектра действия

.

заявл. Environ. Microbiol.

67

,

1

5

. [10]

(

2002

)

Lactobacillus plantarum MiLAB 393 производит противогрибковые циклические дипептиды цикло ( L -Phe- L -Pro) и цикло ( L -Phe-trans-4-OH- L -Pro) и фенилмолочная кислота

.

заявл. Environ. Microbiol.

68

,

4322

4327

. [11]

(

1996

)

Плесень при порче пищевых продуктов

.

Внутр. J. Food Microbiol.

33

,

85

102

. [12]

(

2002

)

Очевидная противогрибковая активность нескольких молочнокислых бактерий против Penicillium disolor связана с уксусной кислотой в среде

.

J. Food Protect.

65

,

1309

1316

.

© 2003 Федерация европейских микробиологических обществ

Противогрибковая активность лактобацилл, выделенных из армянских молочных продуктов: эффективный штамм и его вероятная природа | AMB Express

Объекты исследования

Объектами исследования служили различные штаммы LAB, выделенные из молочных продуктов: Lactobacillus rhamnosus R-2002 (инвентарный номер KY054594, представленный в GenBank), L.delbrueckii subsp. lactis INRA-2010-4.2 и L. delbrueckii subsp. bulgaricus INRA-2010-5.2 хранится в микробном депозитарном центре (MDC) (Научно-производственный центр «Армбиотехнология» Национальной академии наук Армении, Ереван, Армения, WDCM 803) под номерами MDC 9661, MDC 9632 и MDC. 9633, соответственно, штаммы RIN-2003-Ls и BAM-2003-Lb были идентифицированы как Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus , штаммы ИНА-5.1 и INA 21.1 были идентифицированы как Lactobacillus rhamnosus , а INRA-2010-h21 как Lactobacillus helveticus в соответствии с многофазным подходом, включающим классические и молекулярные методы (Базукян, 2018). Все штаммы повторно культивировали на среде обезжиренного молока. Среда для обезжиренного молока была восстановлена ​​(10% мас. / Об.) Из сухого молока (Катнарат, Армения), а затем стерилизована при 110 ° C в течение 15 мин. Исходные культуры LAB хранили при -20 ° C в бульоне De Man, Rogosa и Sharpe (MRS, Hi-Media, Индия), содержащем 20% глицерина (вес / объем).Перед использованием штаммы дважды размножали в соответствующем бульоне и культивировали в течение ночи при оптимальной температуре (30–42 ° C).

Для изучения противогрибковой активности все выделенные штаммы культивировали на модифицированных средах MRS следующего состава: пептон 10 г / л, мясной экстракт 10 г / л, дрожжевой экстракт 5 г / л, глюкоза 20 г / л, цитрат аммония 2 г. / Л, MgSO 4 0,05 г / л, Твин-80 0,8% об. / Об., Агар-агар 1,5% мас. / Об. Все использованные реагенты были произведены Hi-Media, Индия.

Изучение противогрибковой активности и ее зависимости от внешних факторов

Противогрибковые свойства исследуемых определяли с помощью хорошо-диффузионного анализа и полной диффузии в агар.Все эксперименты проводились с модифицированной средой MRS, поскольку она была эффективной для роста грибов и LAB. В то же время не существует конкретных сред, подходящих для культивирования грибов (например, среды Сабуро), на которых можно было бы получить соответствующий рост LAB. В качестве тест-организмов использовали различные группы грибов: Candida guilliermondii NP 4 (предоставлено проф. Л. Навасардяном, кафедра биохимии, микробиологии и биотехнологии, Ереванский государственный университет, Ереван, Армения) (Навасардян и др.2017), Candida albicans 301 (выделено из клинического материала), Debaryomyces hansenii , Mucor plumbeus , Geotrichum Candidum, Fusarium sp. CB1853, Cladosporium sp. (Выделено из испорченной пищи) [идентифицировано и предоставлено лабораторией биополимерного взаимодействия, сборки, функции и взаимодействия белков (FIRL), Национального исследовательского института агрономии (INRA), Нант, Франция] (Ахмадова и др. 2013), Aspergillus flavus, Penicillium aurantioviolaceum и Trichoderma viride (выделено из испорченной пищи и идентифицировано доктором П.К. Григорян, Научно-исследовательский институт биологии Ереванского государственного университета, Ереван, Армения).

Используя метод хорошо-диффузии (Ndagano et al. 2011), суспензию со спорами грибов (10 4 спор на мл) или 0,1 мл культуральной жидкости дрожжей (которая содержала 10 4 клеток на мл) добавляли в Петри. чашку и покрывают модифицированным MRS 1,5% масс. / об. агара. Затем LAB выращивали в течение 24 часов в среде MRS, и 0,1 мл каждой культуральной жидкости LAB добавляли в лунки как в нативных условиях, так и после доведения pH до 6.5. Противогрибковое действие бесклеточного супернатанта бактерий определяли тем же методом. Противогрибковую активность определяли по отсутствию роста грибков / дрожжей вокруг лунки. Используя диффузию в агар, 70 мкл ночной культуры LAB добавляли в маленькие (7 мл) чашки Петри и покрывали модифицированным агаром MRS. В течение 48 ч на поверхность питательной среды наносили суспензии спор грибов. Суспензии спор грибов готовили через 7–10 дней роста грибов до полной споруляции, после чего споры собирали пластиковой микробиологической петлей в 100 мМ фосфатном буфере (pH 6.5), а количество спор определяли в счетной камере «Malassez» (Германия). Количество спор доводили до 10 4 на мл.

Влияние продолжительности культивирования на противогрибковую активность было установлено путем выращивания LAB в течение 24 и 48 часов на модифицированной среде MRS. Для проверки стабильности pH после культивирования в течение 48 часов pH культуральной среды LAB доводили до различных значений pH (от 3 до 10, с помощью концентрированной HCl или 40% мас. / Об. NaOH), а затем определяли противогрибковую активность.Для проверки температурной стабильности после культивирования в течение 48 ч культуральные жидкости LAB обрабатывали при различных температурах в диапазоне 45–80 ° C в течение 15 мин, после чего определяли противогрибковую активность.

Противогрибковая активность концентрированного (10 ×) супернатанта при испарении в «Универсальной вакуумной системе UVS 800 DDA Speed ​​Vac GMI» (США), а также противогрибковая активность концентрированного (22,5 ×) супернатанта при лиофилизации в «HETO DRY WINNER DW». 6-85-1 ”(серийный N 21057B, Дания) при -90 ° C и вакууме 6-7 мбар определяли методом диффузии в лунках.

Определение противогрибковой активности, связанной со стенкой бактериальной клетки

Противогрибковую активность, связанную со стенкой бактериальной клетки, определяли через 48 часов культивирования, когда биомассу LAB отделяли от культуральной жидкости и дважды промывали 0,9% NaCl. Затем биомассу обрабатывали лизоцимом 10 мг / мл и ультразвуком 70 МГц с помощью ультразвукового устройства («Labsonic 2000, B. Braun», Германия). Клеточные стенки отделяли от содержимого цитоплазмы центрифугированием. После разделения примерно 0.1 мл клеточных стенок добавляли в стерильные чашки Петри и покрывали модифицированным агаром MRS. После полимеризации на поверхность носителя было добавлено 10 4 спор плесени.

Использовали два контроля. Первым был рост 10 4 спор грибов на поверхности модифицированного MRS. Второй — рост спор грибов на поверхности модифицированного MRS с добавлением свободных от спор и клеток супернатанта грибов и 1% LAB. Споры и бесклеточный супернатант получали фильтрованием культуральной жидкости через 0.Фильтр 2 нм. Споры и бесклеточный супернатант всех нитчатых грибов, даже если противогрибковая активность против них не была установлена, использовали в качестве элиситоров.

Определение природы противогрибковой активности и очистка ее компонента

LAB оценивали природу противогрибковой активности при обработке образцов различными ферментами. Действие ферментов определяли инкубацией суспензии клеток с протеиназой К и трипсином при конечной концентрации 0.1 мг / мл в 20 мМ фосфатном буфере (pH 7,0) и пепсин в концентрации 0,1 мг / мл в 20 мМ глицин-HCl (pH 2,0). После инкубации в течение 24 ч реакции останавливали центрифугированием.

Частичная очистка противогрибкового компонента производилась только из LAB-клеток, но не из супернатанта. После 48 ч культивирования LAB в модифицированном бульоне MRS биомассу отделяли центрифугированием в течение 5 мин при 11 200 g . Биомассу дважды промывали 0,9% NaCl и ресуспендировали в дистиллированной воде.Суспензию замораживали при -20 ° C в течение ночи. После этого пробирки инкубировали при 63 ° C в течение 30 мин. Затем биомассу обрабатывали лизоцимом 10 мг / мл в течение 1 ч при 37 ° C и ультразвуке 70 МГц «Labsonic 2000, B. Braun» (Германия). Клеточные стенки отделяли от содержимого цитоплазмы центрифугированием при 15000 g в течение 5 мин. После разделения супернатант и клеточные стенки обрабатывали добавлением 4 M мочевины, 20% Tween 80, 20% Triton X-100 или смесью этих компонентов (4 M мочевина, 1% Tween 80 и 1% Triton X-100. ), как описано (Lavermicocca et al.2000; Джонсон 2013). Остаточную противогрибковую активность измеряли описанным выше методом.

Использованные реагенты и обработка данных

Агар-агар и дрожжевой экстракт были от Becton, Dickinson and Co. (США-Франция), пептон и среда MRS были от Hi-Media (Индия). Остальные использованные реагенты были от Sigma-Aldrich Co. (США). Кроме того, протеиназа К из Tritirachium album с ≥ 30 ед. / Мг, пепсин из слизистой оболочки желудка свиньи с ≥ 250 ед. / Мг и трипсин из поджелудочной железы крупного рогатого скота с ≥ 10 000 единиц BAEE / мг были от Sigma (США).

Все эксперименты независимо повторяли трижды. Средние значения и стандартные отклонения были рассчитаны с использованием программного обеспечения Statgraphics (Statpoint Technologies, Inc., Warrenton, VA, USA). Проект статистических вычислений версии R 3.1.0 (Фонд статистических вычислений R, Вена, Австрия) использовался для оценки статистической значимости полученных данных с помощью критерия t Стьюдента, P <0,05, если не упомянуто.

Противогрибковая активность фениллактической кислоты против плесени, выделенной из хлебобулочных изделий

Повышенный интерес к биосохранению пищевых систем в последнее время привел к разработке новых природных антимикробных соединений различного происхождения.Были исследованы различные системы предотвращения порчи пищевых продуктов; к ним относятся системы животного происхождения (лизоцим, лактиферрин, магаинины и т. д.), продукты растительного происхождения (фитоалексины, травы, специи) и микробные метаболиты, включая бактериоцины, перекись водорода и органические кислоты (12). Некоторые из основных методов консервирования пищевых продуктов (например, низкая температура, низкая активность воды, подкисление и т. Д.) Действуют путем инактивации спойлеров, в то время как большинство новых или появляющихся методов (облучение, электропорация, высокое гидростатическое давление и т. Д.)) действуют путем прямой инактивации микроорганизмов. В настоящее время в случае хлеба и хлебобулочных изделий, которые могут быть заражены различными плесневыми грибами (в основном виды Aspergillus и Penicillium ), заражение можно предотвратить, облучив продукт инфракрасными лучами или микроволнами с помощью модифицированного в атмосфере или путем добавления ингибиторов грибков, таких как этанол, пропионовая кислота, сорбиновая кислота и уксусная кислота (17). В частности, пропионовая кислота и ее соли обычно используются для продления срока хранения хлебобулочных изделий.В последнее время уровни химических консервантов, разрешенные в хлебобулочных изделиях в Европе, были снижены в связи с применением Директивы ЕС 95/2 / CE (1), которая допускает концентрации пропионатных и сорбатных солей 0,3 и 0,2% (вес / вес), соответственно, для фасованного нарезанного хлеба, хотя последний используется редко из-за его вторичного воздействия на объем хлеба (17). Когда 0,3% (вес / объем) пропионата кальция тестировалось в анализе конидиального прорастания с несколькими плесневыми грибами, загрязняющими хлебобулочные изделия, рост грибов все же происходил, что позволяет предположить, что использование субоптимальных концентраций соли не может гарантировать сохранность (16).Среди натуральных систем консервирования давно известно, что закваска увеличивает срок хранения хлеба и хлебобулочных изделий. Рокен (25) заметил, что противогрибковая активность закваски строго связана с производством уксусной кислоты. Совсем недавно было изучено использование заквасочных молочнокислых бактерий для подавления роста плесени, что привело к идентификации штамма Lactobacillus plantarum 21B, фильтрат культуры которого показал важную противогрибковую активность. Было показано, что фенилмолочная кислота (PLA) является одним из основных соединений, встречающихся в культуре, вместе с молочной кислотой и уксусной кислотой (16).Dieleveux et al. (8) выделили PLA из фильтрата культуры Geotrichum Candidum и охарактеризовали ее как основное соединение, ответственное за активность против Listeria , проявляемую культурой грибов. Эти авторы получили соответствующее ингибирование роста патогенов в анализе с диффузионной лункой в ​​агаре с использованием dl-PLA, в то время как d-3-PLA ингибировал рост Listeria monocytogenes , культивируемых в жидкой среде или в цельном молоке при сверхвысоких температурах, и рост нескольких штаммы Staphylococcus aureus , Escherichia coli и Aeromonas hydrophila на твердой среде (6, 7).Сообщается, что PLA является одной из самых распространенных ароматических кислот, которым приписывают антибактериальные свойства, и встречается в нескольких медах с различным географическим происхождением (28, 31).

В этом исследовании оценивалась противогрибковая активность PLA против различных видов грибов, выделенных из хлебобулочных изделий и муки, и двух штаммов, продуцирующих охратоксин А, выделенных из злаков. Для каждого штамма определяли минимальную фунгицидную или ингибирующую концентрацию PLA вместе с поведением в условиях pH, более сходных с таковыми в реальных пищевых системах в отношении способности ингибировать и задерживать рост плесени.Также было исследовано влияние PLA в сочетании с основными органическими кислотами, продуцируемыми в культуре L. plantarum 21B.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Противогрибковые вещества.

dl-β-PLA был поставлен Sigma-Aldrich Division (Милан, Италия), l — (-) — β-PLA и d — (-) — β-PLA были поставлены Fluka (Sigma-Aldrich Division, Милан). , Италия), а молочная и уксусная кислоты — Carlo Erba (Милан, Италия).

Грибковые культуры.

Все штаммы грибов, использованные в этом исследовании, были выделены из хлебобулочных изделий, пшеничной муки или злаков (Таблица 1).В частности, Aspergillus flavus ITEM5134 и ITEM5135, Aspergillus niger ITEM5132, Aspergillus terreus ITEM5136, Penicillium brevicompactum ITEM5140, Penicillium sp. штаммы ITEM5147 и ITEM5148 (виды, морфологически родственные P. brevicompactum , но еще не охарактеризованные), Penicillium chrysogenum ITEM5151 и ITEM5152, Penicillium citrinum ITEM5144, ITEM5145, и ITEM14514illium communic , ITEM5143 и ITEM5141, Penicillium solitum ITEM5149 и Fusarium sp.штамм ITEM5153 был выделен в Апулии, Италия, идентифицирован и подтвержден различными морфологическими процедурами (14, 22, 26) и депонирован в Коллекции культур ITEM Института наук о производстве пищевых продуктов CNR, Бари, Италия. A. flavus FTDC3226 и A. niger FTDC3227 были получены из коллекции культур факультета пищевых технологий Университета Лериды, Лерида, Испания; Penicillium roqueforti IBT18687 и два штамма продуцентов охратоксина А, Aspergillus ochraceus FR21991 и Penicillium verrucosum FR22625, были получены из коллекции культур Технического университета Дании, Люнгби, Дания.Для некоторых штаммов был проведен анализ высокоэффективной жидкостной хроматографии экстрактов культур, полученных с помощью микромасштабной экстракции (27), для определения хроматографических профилей метаболитов. В частности, продукция цитринина была установлена ​​для трех штаммов P. citrinum , в то время как три штамма A. flavus не продуцировали афлатоксины при выращивании на твердой среде дрожжевого экстракта, сахарозного агара (26) и дрожжей Чапека. экстракт агара (23).

Приготовление суспензии посевного материала.

Конидии грибов собирали из 7-дневных культур на картофельном агаре с декстрозой (PDA) (Difco Laboratories, Детройт, штат Мичиган), дважды промывали дистиллированной водой и наносили аликвоту 50 мкл каждой суспензии конидий на PDA. планшеты и инкубировали при 26 ° C в течение 72 часов. Конидии собирали с использованием 0,05% (об. / Об.) Triton X-100, и 10 мкл конидиальной суспензии, содержащей примерно 5 × 10 4 конидий, использовали в качестве инокулята.

Решения PLA.

Предварительные эксперименты показали, что существенных различий не было ( P > 0.05) в ингибирующей активности против A. niger FTDC3227 между рацемическим и d- и l-изомерами PLA в концентрации 20 мг / мл -1 ; поэтому во всех экспериментах использовали dl-β-PLA.

(i) Оценка MIC и MFC.

Для определения 90% MIC (MIC 90 ) и минимальной фунгицидной концентрации (MFC), исходный раствор PLA (pH 2,6), содержащий 20 мг PLA мл -1 в бульоне гидролизата пшеничной муки (WFH) (11 ) был серийно разбавлен для получения концентраций 15, 10, 7.5, 5, 3,75, 2,5 и 1,87 мг / мл -1 , и препараты стерилизовали фильтрованием. Раствор ВФГ использовали в качестве контроля.

(ii) Влияние pH на активность PLA.

Для тестирования PLA при значениях pH, близких к значениям pH в реальных пищевых системах, влияние pH на активность PLA было проанализировано с использованием A. niger FTDC3227. Значения pH 2,6, 4,0, 4,5, 5,0 и 5,5 были получены растворением PLA (20 мг мл -1 ) в WFH, разведенном 1: 1 (об. / об.) водой и фосфатным буфером, содержащим 0.18, 0,22, 0,25 и 0,3 моль KH 2 PO 4 -K 2 HPO 4 литров -1 соответственно. В качестве контрольного раствора использовали WFH, разведенный водой 1: 1.

(iii) Противогрибковая активность PLA при pH 4.

Противогрибковая активность при pH 4 оценивалась с использованием всех штаммов грибов и растворов PLA, содержащих 20, 15, 10, 7,5, 5 и 3,75 мг PLA мл -1 в WFH, разведенном 1: 1 (об. / Об.) Фосфатным буфером при различных концентрациях (0.18, 0,12, 0,08, 0,06, 0,04 и 0,03 моль KH 2 PO 4 -K 2 HPO 4 литров -1 соответственно). В качестве контрольного раствора использовали WFH, разведенный водой 1: 1.

(iv) Ингибирующее действие PLA в присутствии других органических кислот. PLA

также испытывали при концентрации 5 мг / мл -1 и pH 4 в присутствии молочной и / или уксусной кислоты в концентрациях, обнаруженных в фильтрате культуры L. plantarum 21B (16) (0.79 и 0,017 мг / мл -1 соответственно) и при следующих более высоких концентрациях: 7,9 и 15,8 мг молочной кислоты мл -1 ; 0,17, 0,34 и 0,67 мг уксусной кислоты, мл -1 ; и 15,8 мг молочной кислоты мл -1 и 0,67 мг уксусной кислоты мл -1 .

Тесты на микроразведение.

Тесты на микроразведение проводили на стерильных одноразовых многолуночных планшетах для микроразбавления (96 лунок; IWAKI; Scitech Div., Asashi Techno Glass, Токио, Япония). Тестовые растворы распределяли в лунки порциями по 190 мкл, засеянными 10 мкл конидиальной суспензии, содержащей примерно 5 × 10 4 конидий.Засеянные лунки готовили в пяти повторностях, а холостые образцы готовили в трех повторностях. Все планшеты для микроразбавления инкубировали во влажной камере при 26 ° C в течение 120 часов. Рост грибов наблюдали с помощью обратного микроскопа и измеряли путем определения оптической плотности при 580 нм каждые 24 часа с помощью спектрофотометра (Labsystem Multiskan MS, версия 3.0, тип 352). В каждый эксперимент включали неинокулированный контроль (WFH, содержащий противогрибковые соединения) и необработанный засеянный контроль. MIC 90 определяли как самую низкую концентрацию PLA, которая приводила по меньшей мере к 90% снижению роста, измеренному по оптической плотности, по сравнению с ростом необработанного контроля после 72 часов инкубации при 26 ° C.Для количественной оценки MFC подсчет грибов в чашках определяли на PDA с использованием 10-мкл порций из лунок, содержащих концентрации PLA выше, чем MIC 90 , концентрацию PLA, равную MIC 90 , и концентрацию PLA, которая была чуть ниже MIC 90 . MFC определяли как самую низкую концентрацию, при которой не наблюдалось прорастания конидий после 72 часов инкубации при 26 ° C. Были выполнены трехкратные определения.

Анализ данных.

Измерения оптической плотности, записываемые каждые 24 часа от нуля до 120 часов, использовали для построения кривых роста для каждого штамма грибов.Модель Гомперца использовалась в качестве математического средства подбора кривых роста для оценки кинетики роста микробов (2). Три точки (оптическая плотность при 72, 96 и 120 ч) контрольной кривой роста были использованы для расчета с помощью модели Гомпертца дополнительного времени (задержка роста, выраженная в часах), необходимого обработанным PLA суспензиям для достижения оптической плотности контроль в то время. Задержки роста относительно контроля в эти три момента (GD 72 , GD 96 и GD 120 , соответственно) были предсказаны моделью Гомперца в тех случаях, когда оптическая плотность контроля не была достигнута. в экспериментальный период.Программа Sigma Plot (SPSS Science Software Gmb, Эркрат, Германия) использовалась для обработки графиков и обработки данных.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты настоящего исследования показывают, что PLA имеет интересный потенциал для практического применения в качестве противомикробного агента в пищевой промышленности из-за его широкой ингибирующей активности против различных пищевых грибов. Виды грибов, исследованные в этом исследовании, ранее были обнаружены в муке, хлебобулочных изделиях и / или злаках и могут продуцировать вторичные биологически активные метаболиты, включая микотоксины.В частности, A. flavus получали из муки, хлеба и хлебобулочных изделий [9, 23; Ф. Валерио, П. Лавермикокка и А. Висконти, Book Abstr. 5-й конгресс Наз. FIMUA (Fed. Naz. Micopatol. Umana Anim.), Стр. 25, 2000], а канцерогенные афлатоксины также были обнаружены в хлебобулочных изделиях (24) и ржаном хлебе (10). Хотя известно, что этот гриб производит афлатоксины, штаммы, оцениваемые в этом исследовании, не показали продукции афлатоксина. И A. ochraceus , выделенные из муки (3, 23) и хлеба (30), и P.verrucosum , который, как сообщается, является загрязнителем тортов (32) и злаков (19), продуцирует несколько микотоксинов, включая охратоксин A. Недавно также было установлено, что охратоксин A продуцируется другими видами грибов, такими как A. niger (13), который также был обнаружен как загрязнитель хлеба (32; Valerio et al., Book Abstr. 5th Congr. Naz. FIMUA). В наших экспериментах MFC PLA для A. ochraceus FR21991 и P. verrucosum FR22625, оба продуцента охратоксина А, были 7.5 и 5 мг / мл -1 , соответственно, при этом наблюдалась только ингибирующая рост активность против A. niger ITEM5132 и FTDC3227. Известно, что P. citrinum продуцирует нефротоксичный микотоксин цитринин, который ранее обнаруживался в хлебобулочных изделиях, заплесневелом хлебе и ржаном хлебе (4, 5, 10, 18, 21, 24). Три штамма-продуцента цитринина, которые были протестированы здесь, также ингибировались PLA (MIC 90 , 7,5 мг / мл -1 ). PLA проявила фунгицидную активность против 13 из 14 протестированных видов, и эти 13 видов включали потенциальные токсигенные организмы, такие как A.ochraceus , A. flavus , P. roqueforti , P. verrucosum и P. citrinum . Это указывает на то, что применение PLA для уменьшения грибковой массы в пищевых системах имеет явное преимущество по сравнению с консервантами, которые сейчас широко используются в хлебобулочных изделиях, такими как пропионовая кислота и ее соли, которые действуют по фунгистатическому механизму (15), который вызывает только временное ингибирование. микробного роста. Аналогично действию других слабокислотных консервантов (пропионовая кислота, бензойная кислота, сорбиновая кислота и т. Д.)) и подкислителями органических кислот (молочная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота и т. д.), активность PLA (pK 3,46), как было показано, зависит от pH, что указывает на то, что его способ действия в некоторой степени связан с липофильными свойствами которые позволяют недиссоциированной форме проникать через микробные мембраны (12). Концентрации PLA, проявляющие противогрибковую активность против плесени, выделенной из хлебобулочных изделий, обычно ниже, чем концентрации, необходимые для антибактериальной активности. Фактически, антимикробная активность PLA была описана для Listeria monocytogenes в концентрации 13 мг / мл -1 и для других патогенов человека ( S.aureus , E. coli и A. hydrophila ) в концентрации 20 мг / мл -1 (7, 8).

Значительный эффект PLA наблюдался также при pH 4, pH изучался в связи с его более широким применением в реальных пищевых системах; при этом pH концентраций ниже 7,5 мг / мл было достаточно -1 , чтобы вызвать как ингибирование более чем 50% роста грибов, так и соответствующую задержку роста для всех тестируемых штаммов. В случае A. flavus (два штамма), P.citrinum (два штамма), P. commune и Penicillium sp. (один штамм), оптическая плотность, эквивалентная оптической плотности контрольных культур, никогда не была достигнута обработанными суспензиями грибов. В заключение следует отметить, что при использовании параметров Гомпертца концентрация PLA 7,5 мг / мл -1 давала непредсказуемые задержки роста (однако задержки роста всегда были более 2 дней) для 12 штаммов, включая общие контаминанты P. roqueforti и A. flavus и микотоксигенные штаммы P.verrucosum и P. citrinum .

Задержка роста, наблюдаемая в этих экспериментах, имеет большое значение для продления сроков хранения пищевых продуктов. В частности, в случае кислотоустойчивого организма P. roqueforti нанесение 5 мг PLA ml -1 (MFC) приводило к полному ингибированию штамма даже при низком pH (pH 3,0). При использовании при pH 4 PLA (7,5 мг / мл -1 ) подавляла развитие грибов на 52% и задерживала рост на непредсказуемое время (т.е.е. уровень загрязнения, наблюдаемый в контроле, не был достигнут в течение 5-дневного эксперимента). Эти результаты подтверждают предыдущие данные, которые показали, что продуцирующий PLA штамм L. plantarum 21B, используемый в качестве закваски для закваски хлеба, задерживал рост A. niger FTDC3227 (16) и P. roqueforti IBT18687 (A Corsetti and P. Lavermicocca, неопубликованные данные) до 7 дней при комнатной температуре. Этот эффект задержки не наблюдался в хлебе, начатом с Lactobacillus brevis 1D, штамма закваски, который в культуре продуцировал примерно такое же количество молочной кислоты и уксусной кислоты, что и L.plantarum 21B (примерно 0,8 и 0,02 мг / мл -1 соответственно для обоих штаммов) (16). Это привело к выводу, что PLA является основным фактором, ответственным за противогрибковую активность и продление срока хранения, производимого L. plantarum 21B в хлебе на закваске, и к заключению, что эти эффекты улучшаются за счет присутствия молочной и уксусной кислот. от пищевых бактерий сообщалось о штамме Propionibacterium freudenreichii и двух штаммах L.plantarum (16, 29). Было показано, что PLA является продуктом метаболизма фенилаланина; в частности, фенилаланин может трансаминироваться в фенилпировиноградную кислоту, которая далее метаболизируется до PLA дегидрогеназой гидроксикислот (29). Таким образом, изменение условий роста бактерий для улучшения продукции метаболитов может привести к выделению штаммов с повышенным продуцированием PLA. Кроме того, скрининг соответствующего количества молочнокислых бактерий из нескольких микробиот, а также исследования ингибирующей активности против других микробных загрязнителей могут расширить потенциальное применение PLA в других пищевых системах.Естественное присутствие соответствующих количеств PLA в нескольких медах из разных географических регионов (28, 31) и очевидное отсутствие токсичности PLA для линий клеток человека и животных (20) может позволить его безопасное использование в пищевых продуктах, даже если информация о нем влияние на реологические свойства и вкус каждой пищевой системы. Таким образом, PLA, как и другие противомикробные вещества, продуцируемые молочнокислыми бактериями, представляет собой многообещающее природное устройство для контроля загрязнителей в пищевых системах. Дополнительным преимуществом по сравнению с некоторыми другими соединениями, такими как уксусная кислота, может быть очевидное отсутствие запаха у растворов PLA.

Поскольку плесень ответственна за загрязнение различных продуктов, предназначенных как для потребления людьми, так и для животных, таких как молочные и мясные продукты, фрукты, овощи и силосы, в ферментированных пищевых продуктах и ​​кормах могут использоваться штаммы молочнокислых бактерий, продуцирующие PLA. для производства антимикробного соединения in situ, тогда как условия для прямого применения PLA должны быть созданы для других пищевых систем.

«Изоляция противогрибковых молочнокислых бактерий из пищевых источников и их» Дэн Чжао

Название степени

Магистр сельского хозяйства — Технология молочных продуктов

Аннотация

Из-за заражения плесенью ежегодно теряется большое количество сыра.Биоконсервация, то есть использование биологических объектов (микробов) и их метаболитов для подавления микробной порчи вместо химических консервантов, в последнее время вызывает все больший интерес. Молочнокислые бактерии (ЛАБ) потенциально могут использоваться в биоконсервации, поскольку они безопасны для употребления и естественным образом присутствуют во многих пищевых продуктах. В этом исследовании пятнадцать штаммов лактобацилл, выделенных из молочных продуктов, овощей и ферментированных солений, были протестированы методом наложения агара на их активность против плесени.Шесть штаммов, выращенных на агаре MRS, показали сильную ингибирующую активность против плесени-мишени ( Penicillium sp. При 10 5 спор / мл), выделенной с поверхности сыра Чеддер. Изоляты идентифицировали с помощью биохимических тестов с использованием полосок API CHL50. Пять штаммов были идентифицированы как Lactobacillus plantarum и один штамм как Pediococcus pentasaceus . Для демонстрации активности против плесени в концентрированных бесклеточных супернатантах использовали метод хорошей диффузии.Супернатанты от всех штаммов показали ингибирование целевой плесени (индикатор). Антиплесневые соединения, полученные с помощью всех штаммов, были термостойкими (100 o ° C в течение 15 мин). Супернатанты от 5 штаммов сохранили активность против плесени, когда pH был доведен до 6,8 ± 0,2, в то время как один штамм DC2, выделенный из сыра, потерял свою активность против плесени при этом pH. Температура инкубации культур влияла на антиплесневую активность. Оптимальным было 37 ° C. При инкубации культур при 10 или 55 ° C отмечалось очень небольшое ингибирование или его отсутствие.

Завершено предварительное исследование применения лактобацилл против плесени в сыре Чеддер. LAB против плесени добавляли к сырному молоку в качестве в качестве добавки с получением 10 5 КОЕ / мл. После созревания в течение 1 недели и 1 месяца на поверхность добавлялась плесень (10 ~ 20 спор), и сыр свободно заворачивался. Следили за появлением плесени на поверхности сыра. Плесень не присутствовала на сыре «NB в молоке» недельной давности до 6 -го дня после того, как на контрольном сыре (изготовленном без штамма NB) появились признаки плесени.Сыр возрастом 1 месяц «NB в молоке» продлил срок хранения на 17 дней дольше, чем контрольный сыр.

.

Check Also

Профессия ит специалист: Профессия IT-специалист. Описание профессии IT-специалиста. Кто такой IT-специалист. . Описание профессии

Содержание Что такое IT специалист — Кто кем работаетСамые востребованные IT-профессии 2021 года / Блог …

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *