Понедельник , 29 ноября 2021
Главная / Разное / Двойное окрашивание фото: 35 модных образов с фото

Двойное окрашивание фото: 35 модных образов с фото

Содержание

Двойное окрашивание на короткие волосы (64 фото)

1

Короткие стрижки с ярким окрашиванием


2

Контрастное окрашивание коротких волос


3

Креативные стрижки


4

Окрашивание колорирование


5

Короткие стрижки с ярким окрашиванием


6

Креативное окрашивание на короткие волосы


7

Блонд на Пикси Боб 2021


8

Колорирование волос на короткие волосы


9

Тонирование на Пикси


10

Молодежное окрашивание на короткие волосы


11

Женские прически


12

Креативные прически на средние волосы


13

Сессон стрижка женская на короткие тонкие волосы


14

Красное мелирование на короткие волосы


15

Красивые женские стрижки


16

Креативное окрашивание


17

Тонирование на Пикси


18

Короткие стрижки с ярким окрашиванием


19

Колорирование на короткие волосы


20

Колорирование на короткие волосы


21

Колорированиена темное каре


22

Мелирование на короткие волосы


23

Окрашивание на короткие волосы


24

Окрашивание для стрижки Пикси Боб


25

Короткие стрижки с колорированием


26

Мелирование на короткие волосы


27

Красивые женские прически


28

Стрижка Гарсон мелирование


29

Стрижки с рыжим цветом волос


30

Креативное окрашивание волос на Светлом фоне


31

Двухцветное окрашивание коротких волос


32

Стрижка каре-Боб на короткие волосы с челкой мелирование


33

Пикси с темными корнями и светлыми концами


34

Креативное окрашивание на короткие волосы


35

Необычные короткие прически


36

Креативное окрашивание


37

Окрашивание на коротки еволосф


38

Креативное мелирование на короткие волосы


39

Колорирование на светлые короткие волосы


40

Окрашивание на короткую стрижку


41

Вуальное мелирование


42

Андеркат женская Боб


43

Окрашивание на короткие волосы мелирование


44

Блочное окрашивание


45

Креативное окрашивание на короткие волосы


46

Креативная стрижка женская шапочка


47

Колорирование на короткую стрижку


48

Необычное окрашивание коротких волос


49

Крутое окрашивание на короткие волосы


50

Цветное окрашивание на короткие волосы Пикси


51

Креативное окрашивание на короткие волосы


52

Блонд с черными прядями


53

Омьре намкороткие волосы


54

Блочное окрашивание на короткие волосы


55

Пикси мелирование на темные волосы


56

Креативные стрижки


57

Двойное окрашивание на короткие волосы технология


58

Пикси мелирование блонд


59

Колорирование на короткие


60

Креативное окрашивание на короткие волосы


61

Мелирование на Гарсон


62

Стрижка Боб каре колорирование


63

Колорирование волос на короткие волосы


64

Стрижки каре Боб каре двойное каре

Двойное окрашивание волос (61 фото)

1

Окрашенные пряди на волосах красивые


2

Короткие стрижки с ярким окрашиванием


3

Креативный парикмахер


4

Стрижки Тони Гай фото


5

Креативное окрашивание на темные волосы


6

Причёски на рыжие волосы длинные


7

Двухцветное окрашивание волос


8

Колорирование на Боб каре на темные волосы


9

Двухцветное окрашивание


10

Окрашивание волос это искусство


11

Колористика волос


12

Креативное яркое окрашивание на длинные волосы


13

Колорирование на каре с челкой


14

Стрижка лесенкой и окраска волос


15

Креативное окрашивание волос


16

Стильное окрашивание волос


17

Креативные прически черный и красный цвет


18

Мажиконтраст мелирование


19

Колорирование на короткие волосы


20

Яркие пряди на волосах


21

Волосы разных цветов на голове


22

Цветные пряди в челке


23

Колорирование блонд Каскад


24

Рванка на средние волосы с челкой


25

Стрижка Боб каре колорирование


26

Прически колорирование


27

Каре окрашивание колорирование


28

Брюнетка с белыми прядями


29

Колорирование для брюнеток


30

Креативное окрашивание


31

Мирко мелирование


32

Окрашивание волос колорирование на светлые волосы


33

Стрижка Каскад асимметрия


34

Красивые стрижки


35

Мелирование с черными прядями


36

Мелирование с пепельным оттенком


37

Креативное окрашивание каре


38

Цветная челка


39

Вуальное мелирование


40

Мажиконтраст мелирование


41

Пикси мелирование 2020


42

Окрашивание на короткие волосы


43

Шамбре колорирование


44

Стрижка шапочка женская на средние волосы


45

Мелирование на тёмные волосы


46

Мажиконтраст мелирование


47

Колорирование на короткие волосы


48

Красивые женские прически


49

Мелирование с прямой челкой


50

Стрижки на длинные волосы колорирование


51

Мелировка колорирование


52

Колорирование на блонд каре


53

Шамбре колорирование


54

Молодая цветная прическа


55

Креативное окрашивание на длинные волосы


56

Модные стрижки и окрашивание на средние волосы


57

Колорирование на асимметричное каре


58

Красные пряди на короткие волосы


59

Рыжие пряди


60

Модные прически на длинные волосы


61

Цветные пряди

Двойное окрашивание на короткие волосы фото

Главная » Окрашивание » Двойное окрашивание на короткие волосы фото

Двойное окрашивание волос (39 фото) – модные тенденции

Двойное окрашивание волос – самый популярный и самый интересный способ преображения.

Качественное окрашивание – гармония образа!

Новый цвет – это всегда новый опыт, новый взгляд на мир и новые ощущения.

  • Мелирование или балаяж;
  • брондирование или деграде;
  • омбре или дипдай – способов изменения цвета множество, и каждый из них имеет свои особенности.

Попытаемся разобраться в основных вариантах салонного искусства преображения.

Разновидности окрашивания

Самый известный и наиболее распространенный способ окрашивания – мелирование. Пожалуй, нет такой модницы, которая ни разу не пыталась примерить на себя столь интересную попытку изменения цвета.

Мелирование – универсальный способ окрашивания

Мелирование универсально – с равным успехом его можно применять как на коротких, так и на длинных волосах. Оно способно преобразить любую стрижку, придать новую глубину любой укладке, радикально изменить образ и вписаться в любой стиль.

Мелирование с тонкими прядками

Суть этой техники изменения цвета волос в следующем: на отдельные пряди волос – толстые и широкие или тоненькие, буквально в несколько волосков – наносится осветлитель, чаще всего перекись водорода.

Под воздействием реагента чешуйки, покрывающие волос, открываются, и пигмент практически вымывается из структуры.

Локоны после окрашивания приобретают светлый оттенок — от медового, до практически, белого цвета, в зависимости от условий:

  • крепости осветлителя;
  • исходного цвета;
  • структуры волоса и других моментов.

Мелирование – отличный способ оживить облик, преобразиться, придать волосам объем и ухоженные вид, даже визуально скинуть несколько лет.

Опытный мастер посоветует:

  • какие именно пряди;
  • какой ширины лучше всего высветлить для вашего типа волос;
  • формы лица и структуры прически;
  • как долго выдерживать осветлитель;
  • как подчеркнуть достоинства и одновременно скрыть недостатки с помощью такого окрашивания.

Мелирование и последующее окрашивание отдельных прядей

Однако у мелирования есть и свои недостатки. В первую очередь стоит сказать, что воздействие перекиси все же достаточно травматичная для волос процедура. К тому же есть риск «передержать» осветлитель и буквально сломать этим волосы.

Примечание!
Обращайтесь только к опытным мастерам, настоящим специалистам своего дела и не пытайтесь мелировать волосы самостоятельно в домашних условиях.

Кроме того, такое высветление довольно быстро потребует коррекции, особенно если делать его максимально контрастным, так как отрастающие корни волос будут очень заметны. Однако мелирование уже многие годы не теряет своей популярности, а количество поклонниц этого метода окрашивания только увеличивается.

Омбре – имитация влияния солнечных лучей

Пожалуй, самый популярный на текущий момент способ неординарного и стильного окрашивания волос – это омбре. Созданный специалистами специально для летних вариантов стрижек, этот вариант имитирует слегка выгоревшие на солнце пряди.

Темные у корней и светлеющие к кончикам, длинные локоны словно рассказывают окружающим, как замечательно их обладательница отдохнула у моря – ведь только соленый ветер и жаркое солнце способны так естественно и нежно получить двойной цвет волос!

Омбре – эффект выгоревших на солнце волос

Омбре с его мягким переходом-переливом цвета – результат долгой и кропотливой работы настоящего профессионала. Чтобы достичь максимально естественного эффекта, приходится использовать не только осветлитель, но и несколько тонов краски одного оттенка, учитывать время выдержки краски, структуру волос и их устойчивость к окрашиванию.

Звезда Голливуда с окрашиванием омбре.

Фото с прическами окрашивания омбре – это всегда вздохи удивления и восхищения талантом мастера и кропотливостью работы. И не удивительно, что на многих таких фотографиях запечатлены звезды мировой величины – Джессика Альба и Дженнифер Лопес, Мэрайя Керри и Лорен Конрад, Дженнифер Эннистон и Сара Джессика Паркер.

Обмре интересно выглядит и на коротких стрижках, согласитесь!

Окрашивание методом брондирования

Еще один, относительно новый способ – широко применяться стал буквально год-полтора – двухцветного окрашивания волос называется брондирование. Название свое этот метод получил благодаря смешению двух английских слов «brown» и «blond», то есть «коричневый» и «светлый». Название весьма точно отражает суть такого способа преобразования.

Натуральный мед и расплавленное золото, растекшиеся по волосам в причудливой смеси, ласковые солнечные зайчики, запутавшиеся в темно-пшеничных прядках – именно такой эффект и дает брондирование.

Брондирование: светлое золото и темный мед

Цель окрашивания – максимально естественно осветлить волосы, создать неповторимый, но обязательно естественный цвет, при котором прическа получает неожиданную глубину, а весь облик – свежесть и блеск юности.

Брондирование – один из самых сложных в технологическом плане способ окрашивания. Чтобы получить требуемый эффект, мастер должен правильно распределить темные и светлые оттенки по всей голове, разбирая прядки и располагая их по заранее составленной схеме.

Нет каких-либо единых наборов для брондирования, так же как и нет строго рекомендованных к использованию цветов: для каждой клиентки мастер подбирает цвета индивидуально.

Выбор оттенков зависит от:

  • цвета кожи;
  • типа лица;
  • длины волос;
  • структуры прически;
  • цвета глаз.

Распределение оттенков по отдельным локонам и прядкам – почти искусство, требующее от мастера большого внимания, опыта и усердия.

Брондирование: смешение светлых и темных оттенков коричневого.

Однако при брондировании необходимо соблюдать некоторые требования:

  • во-первых, краска не должна различаться больше, чем на три тона.
  • во-вторых, для получения максимально естественного эффекта высветлять прядки необходимо не от самых корней, а отступив от кожи головы не меньше, чем на 3-5 см.
  • в-третьих, нельзя осветлять волосы до белого или почти белого цвета, так как брондирование – это, прежде всего, естественность и натуральность.

Огромный плюс такого способа окрашивания – отсутствие необходимости проводить частые коррекции. Отрастая, темные корни плавно и красиво переходят в светлые пряди, словно выгоревшие на концах.

Однако у брондирования есть и свои минусы. Главный из них – сухость. Пряди на концах – сухие и жесткие на ощупь, иногда даже ломкие и секущиеся — требуют отдельного внимания при уходе.

На заметку!
Стоит помнить, что ни в коем случае не стоит пренебрегать специальными средствами ухода, в том числе увлажняющими бальзамами и масками.

Второй минус метода — его цена.

Брондирование – одно из самых дорогих двойных окрашиваний из-за его:

  • сложности;
  • длительности;
  • высоких трудозатрат.

Однако результат стоит того – ухоженные, великолепно ниспадающие волосы, роскошной волной рассыпающиеся по плечам.

Преимущества и недостатки двойного или американского колорирования

Метод, пользующийся огромным успехом у отчаянных модниц, всегда стремящихся выделяться из толпы – двойное колорирование, чаще называемое американским колорированием или американским мелированием.

Название этот метод получил по причине небывалой популярности среди мировых знаменитостей, поп-, панк- и рок-звезд, стремящихся выглядеть максимально броско и ярко.

Суть его заключается в следующем: в общей массе волос выбирается отдельная прядь или несколько прядей, которые затем окрашиваются в контрастные яркие цвета – красный, зеленый, синий, угольно-черный. Для получения чистого оттенка пряди чаще всего предварительно высветляются перекисью.

Это окрашивание – для самых смелых модниц, для девушек, стремящихся выглядеть экстравагантно и необычно, жаждущих выделиться из толпы, вознестись над серыми и унылыми буднями, раскрасить мир яркими красками.

Американское мелирование: доминирующие оттенки красного.

Техника выполнения двойного колорирования очень похожа с обычным мелированием. Выбранные пряди отделяются от основной массы и обрабатываются осветлителем.

Для светлых волос этот этап не обязателен, однако многие мастера настаивают на предварительном высветлении, чтобы впоследствии не получить неприятных сюрпризов с выбранным ярким цветом.

После того, как перекись смыта, эта же прядь окрашивается в нужный оттенок.

Наибольшей популярностью пользуются красные тона:

  • рубин,
  • шиповник,
  • бордо,
  • бургундия,
  • огненно-алый,
  • спелая вишня,
  • коралл,
  • чили.

Однако в последнее время набирают популярность и рыжие оттенки:

  • медь,
  • красная глина,
  • темное золото,
  • оранжевый закат и прочие.

После нанесения краски пряди оборачиваются фольгой. Краска выдерживается порядка 30 минут – в зависимости от рекомендаций производителя, смывается, а на волосы наносится защитный бальзам. Как видим, инструкция несложная, и окрасить, таким образом, волосы своими руками в домашних условиях совсем не сложно.

Из минусов двойного колорирования стоит отметить, пожалуй, острую необходимость в дальнейшем уходе за окрашенными волосами. Обязательное использование кондиционеров и бальзамов, защитных спреев и пенок уже не вызывает сомнений.

Резюме

Независимо от того, какой именно метод придется вам по вкусу, на окрашенные волосы необходимо раз в неделю наносить специальные восстанавливающие и защитные маски, которые будут питать ослабленные волосы. Об этом читайте в других статьях нашего сайта.

Видео в этой статье расскажет более подробно о способах двойного окрашивания локонов, смотрите!

shpilki.net>

Преображающее окрашивание волос в два цвета

Предпочитая однотонному окрашиванию локонов, окрашивание волос в два цвета — удается не только преобразить образ, но и сделать его по максимуму уникальным.

Ведь оставаться неповторимой – природное желание девушек и женщин.

Как правило, первое, что привлекает во внешности и выделяет из одноликой толпы — это прическа. При этом волосы не обязательно должны иметь яркий и экстравагантный цвет.

На фото ниже можно увидеть экстравагантное и стильное окрашивание.

Фото:


Сегодня в моде природные мотивы, красоту которых может усилить двойное окрашивание волос.

Варианты таких причесок представлены на фото в нашей статье, а о том, как проводится тонирование в два цвета, расскажут присутствующие в статье видео материалы.

Преимущества двухцветного тонирования волос

Окрашивание волос в два цвета имеет много интересных наименований, среди них омбре или деграде, поперечное и частичное колорирование, техника с названием балаяж и т.д.

Все упомянутые названия представляют собой способы двухтонального окрашивания с гармоничным переходом от одного цвета к другому.

При этом разница между технологиями нанесения краски все же существует. Получить больше информации о том, как лучше покрасить волосы в два цвета, можно из предложенного видео материала.

Видео:

Если судить по фото девушек с локонами, окрашенными двумя цветами, можно отметить массу преимуществ, которые дает двухтональная покраска прядей.

В отличие от тонирования волос одним цветом, двойное окрашивание позволяет сформировать привлекательный эффект объема укладке.

Особенно этот факт важен для обладательниц прямых и тонких прядей. Плавный переход одного оттенка в другой создает игру света, и со стороны прическа кажется пышнее.

Окрашивание локонов в два цвета – идеальный вариант для женщин, желающих освежить образ.

При этом данная технология не подчеркивает недостатки кожи, которые могут проявить себя в виде морщинок и прыщей, наоборот, она делает лицо привлекательнее и моложе.

К тому же, подходит к любому цветотипу внешности.

Мелирование – одна из технологий двухцветного окрашивания

Мелирование – самая первая двухцветная техника окрашивания локонов.

Путем обесцвечивания выборочных прядей из общей массы волос, оно позволяет получить эффект «выгоревших» на солнце локонов.

Несмотря на частичное окрашивание, процедура не является безопасной, так как обесцвечивание волосков отрицательно влияет на их структуру. На фото ниже можно видеть, что получается в результате двухцветного мелирования.

Фото:

Поэтому после изменения цвета волос, необходимо позаботиться и о восстановлении их здоровья. С этой целью приобретают мягкие увлажняющие шампуни и питательные бальзамы.

К тому же, осветленные пряди со временем отрастают и теряют свой изначальный лоск. В зависимости от формы окрашивания, примерно через месяц может потребоваться их коррекция.

Мелирование может выполняться в нескольких вариантах:

  • Мажимеш – щадящий способ покраски прядей, выполняется крем-краской, дополненной воском. Так как в красящий состав не входит перекись водорода, волосы можно окрасить только в медовый и золотой оттенки, но не в платиновый;
  • Балаяж – новомодная методика окрашивания локонов в два цвета. Работают краской, отличающейся оттенком от базового цвета волос, обрабатывают только кончики прядей. На слишком коротких стрижках балаяж выполняют иначе, чем на длинных прядях. Сначала делают начес, затем наносят краску на кончики с помощью фольги;
  • Шатуш – иногда эту технику именуют «солнечным поцелуем». Подходит этот вид окрашивания в два цвета, как для блондинок, так и для темных волос брюнеток или шатенок. Техника подразумевает создание прядей с эффектом выгорания на солнце. Сделать переход между оттенками позволяет специально выполненный в процессе окрашивания начес. При желании придать укладке естественный на вид объем, нанесение краски может выполняться в глубине шевелюры.

Как мелирование делают настоящие мастера, можно посмотреть на этом видео.

Видео:

Колорирование – окрашивание локонов двумя цветами

Данный вид окрашивания волос в два цвета предусматривает разделение прядей на проборы и их окрашивание, либо путем плавного перехода в два цвета, либо с подчеркиванием контраста.

На данный момент колористы могут работать в нескольких направлениях:

  • Омбре – другие названия «деграде» или поперечное колорирование. Выполнение действий мастера сводится к формированию на волосах эффекта отросших прядей за счет темных корней и осветленных кончиков. Мастер может выполнить как слишком резкий переход, так и постепенный. При этом двухцветное окрашивание омбре эффектно смотрится как на темных коротких прядках, так и на волосах средней длины;
  • Брондирование – техника бронд является распространенным видом колорирования. В наименовании соединено два понятия «блонд» и «брюнет», результат применения брондирования выглядит как естественное сочетание двух цветовых оттенков с минимальным контрастом. Такая техника идеально подходит для окрашивания волос блондинок. Мастером используются в основном бежевые, коричневатые и золотые оттенки;
  • 3д-окрашивание – применение этой техники также позволяет выполнить окрашивание в два цвета с использованием из одной гаммы разных тонов. Техника считается самой сложной, пример ее исполнения можно посмотреть в видео.

3д-окрашивание на фото можно увидеть на фото ниже.

Фото:

Как самостоятельно окрасить волосы в два оттенка?

Приняв решение выполнить окрашивание прядей самостоятельно в два цвета, необходимо учесть, что результат может оказаться неожиданным даже для коротких волос.

Двухцветное окрашивание – сложная технология. И если обычное мелирование или омбре самому выполнить еще возможно, то украшение локонов по 3д технологии рекомендуется проводить только у профессионального мастера-колориста.

Тот факт, что удалось прикупить профессиональную краску для самостоятельного двухцветного окрашивания, не является залогом качественного результата.

Зачастую, чтобы добиться плавного перехода оттенков, мало знать правила нанесения краски, кроме того, приходится выравнивать базовый цвет волос.

О том, как специалист выполняет окрашивание локонов в два цвета, расскажет следующий видео материал.

Видео:

Далее следует инструкция для тех женщин, которые решили выполнить окрашивание своих волос в два цвета, не прибегая к услугам мастера.

В первую очередь, нужно запастись всеми необходимыми рабочими материалами.

Понадобятся:

  1. несколько кисточек для нанесения разных оттенков краски;
  2. фольга для фиксирования обработанных локонов;
  3. краска;
  4. емкость для смешивания красящего состава.

От правильного подбора оттенков краски зависит эффективность результата.

Поэтому рекомендуется либо сразу приобретать уже собранный набор для проведения колорирования, либо покупать средства из одной косметической линейки.

При этом желательно выбирать цвета, которые будут светлее или темнее на 3 тона от базового оттенка волос.

Перед процедурой нужно удобно разложить все рабочие материалы вблизи себя, затем обязательно ознакомиться с инструкцией, и провести тест на наличие аллергической реакции организма.

Этапы двухцветного окрашивания:

  • От общей копны волос нужно отделить пряди, подлежащие окрашиванию, эти волосы лучше зафиксировать заколками. Чтобы результат окрашивания получился аккуратным, не стоит отделять пряди шириной больше чем 0,5 см;
  • Поочередно под каждую прядку подкладываем квадратик фольги, при этом ее край возле корней нужно подогнуть вниз. Далее аккуратно наносим определенный тон краски на волосы, заворачиваем их в фольгу так, чтобы волоски удерживались в ней прочно. С другими прядями волос продолжаем подобные действия, вначале двигаться необходимо от челки к затылочной части;
  • Выдержав окрашивающий состав на голове указанный в инструкции промежуток времени, пряди нужно тщательно вымыть с мягким шампунем;
  • Далее на влажные пряди наносим увлажняющий бальзам или маску для восстановления здорового состояния волос. Лучше, если это средство будет находиться в комплекте с используемой краской;
  • Волосы нужно подсушить естественным путем без использования фена, ведь осветление и без того оказывает травмирующее воздействие на структуру волосков.

В завершении предлагаем ознакомиться с видео инструкцией на тему, как осуществить процедуру окрашивания волос в два цвета в домашних условиях.

Видео:

vmirevolos.ru>

Мелирование волос (50 фото) — Модный цвет 2017

Мелирование — едва ли не самый лучший способ придать образу яркости, свежести и выразительности, при этом не подвергая шевелюру окраске полностью

Одним из самых лучших способов оживить прическу, да и весь образ в целом, является мелирование волос. Модный цвет 2017 выступает за естественность оттенков. Любая представительница прекрасного пола знает, как важен уход за волосами, какую роль цвет, укладка, прическа и прочие детали играют во внешнем виде. Мелирование — едва ли не самый лучший способ придать образу яркости, свежести и выразительности, при этом не подвергая шевелюру окраске полностью. Современные технологии допускают применение огромного количества методик, щадящих волосы, наносящих минимальный вред, зато превращающих вашу прическу в совершенно новую.

Содержание

  • Разнообразные техники частичного окрашивания
  • Мелирование длинных волос
  • Оригинальное окрашивание коротких волос
  • Модный колор
  • Интересные цвета для светлых волос
  • Мелирование темных локонов
  • Тонкости частичного окрашивания
Современные технологии допускают применение огромного количества методик, щадящих волосы, наносящих минимальный вред, зато превращающих вашу прическу в совершенно новуюМодный в этом сезоне серый оттенок может быть использован в мелированииМелирование длинных светлых волос

Разнообразные техники частичного окрашивания

На сегодняшний день индустрия красоты готова порадовать поклонниц смены стиля множеством способов мелирования волос. Самыми популярными техниками окрашивания части волос в текущем году стали:

  • шатуш,
  • французское (оно же мажимеш),
  • калифорнийское и венецианское мелирование,
  • омбре и балаяж,
  • брондирование.
Яркое мелирование на темные волосыИзвестно, что частичное окрашивание подходит как длинноволосым девушкам, так и обладательницам коротких стрижек, главное — лишь правильно подобрать способ окраски и цветОкрашивание кончиков в контрастный цвет

Известно, что частичное окрашивание подходит как длинноволосым девушкам, так и обладательницам коротких стрижек, главное — лишь правильно подобрать способ окраски, цвет, убедиться в том, что мелирование подойдет к типу лица, будет сочетаться с тоном кожи и цветом глаз. Важно правильно выбрать теплые или холодные оттенки краски подойдут вам, для того чтобы мелирование сослужило свою службу, заставив вас полностью преобразиться.

Совет! Для подбора наиболее подходящего типа частичного окрашивания обратитесь к специалисту-парикмахеру, который даст разумный совет по выбору техники окрашивания, основываясь на состоянии здоровья шевелюры, а также на том, подойдет конкретно вам такой тип окраски или нет.

Окрашивание кончиков в контрастный цветЭто довольно сложная методика смены цвета, главный плюс которой — необходимость делать коррекцию мелирования не чаще раза в 2–3 месяцаЛучше всего шатуш смотрится на темных волосах, желательно средней длины и больше. Не подходит для коротких стрижек

Шатуш — такой способ окраски, при котором осуществляется плавный переход из цвета в цвет, темнее у корней и светлее к кончикам. Это довольно сложная методика смены цвета, главный плюс которой — необходимость делать коррекцию мелирования не чаще раза в 2–3 месяца. Лучше всего шатуш смотрится на темных волосах, желательно средней длины и больше. Не подходит для коротких стрижек.

Французское мелирование — способ, подходящий обладательницам светлых волос, исключительно выигрышно смотрящийся на локонах русых оттенков. При выполнении такого способа прядки окрашиваются в несколько тонов, чуть светлее и темнее натурального цвета, в произвольном порядке от корней до кончиков.

Французское мелирование — способ, подходящий обладательницам светлых волос, исключительно выигрышно смотрящийся на локонах русых оттенковПри выполнении такого способа прядки окрашиваются в несколько тонов, чуть светлее и темнее натурального цвета, в произвольном порядке от корней до кончиков

Калифорнийская и венецианская техники окрашивания, по сути, схожи между собой. Но калифорнийская техника предполагает эффект выгорания на солнце, солнечных зайчиков, будто бы запутавшихся в прическе. Выполняется щадящим образом так, что темный у корней цвет становится все светлее к кончикам. Такая методика очень хорошо смотрится на темно-русых, каштановых локонах. Венецианское же мелирование предполагает такое же разнообразие оттенков, сосредоточенное на кончиках волос, но в данном случае эти оттенки — темные.

калифорнийская техника предполагает эффект выгорания на солнце, солнечных зайчиков, будто бы запутавшихся в прическеВыполняется щадящим образом так, что темный у корней цвет становится все светлее к кончикамТакая методика очень хорошо смотрится на темно-русых, каштановых локонахВенецианское же мелирование предполагает такое же разнообразие оттенков, сосредоточенное на кончиках волос, но в данном случае эти оттенки — темные

Омбре, одна из самых популярных техник покраски — это переход из одного цвета в другой на середине линии роста. Цвета могут быть какими угодно, но чаще всего на темные волосы выполняется контрастный светлый, а на светлые — наоборот. Схожий с ним балаяж выполняется куда сложнее и чаще только на светлых локонах. Тонкие мазки краски по верхнему слою шевелюры создают эффект слегка выгоревшей прически.

Омбре, одна из самых популярных техник покраски — это переход из одного цвета в другой на середине линии роста волосЦвета могут быть какими угодно, но чаще всего на темные волосы выполняется контрастный светлый, а на светлые — наоборотСочетание модных оттенков

Наконец, брондирование, довольно новая процедура, являющаяся диаметрально противоположной высветлению волос. Брондирование предполагает окрашивание части шевелюры в контрастно-темные цвета, плавный переход от корней к светлым кончикам или же частичное окрашивание в темный.

Совет! Прежде чем выбрать мастера, который будет заниматься мелированием, внимательно ознакомьтесь с отзывами о его работе. Некоторые техники, как, например, балаяж, довольно трудны в исполнении и качественно осуществить процедуру окраски сможет только настоящий профессионал.

Мелирование длинных волос

Длинноволосым красавицам, как всегда, везет, ведь роскошные длинные локоны — настоящий холст для грамотного парикмахера, они дают возможность вволю разгуляться фантазии, выполнить красивое мелирование, которое заставит шевелюру заиграть массой новых оттенков. Известно, что длинные волосы нуждаются в куда большем количестве питательных веществ и сильнее подвержены сухости, ломкости, чем короткие, так как организм не всегда в состоянии обеспечить всем необходимым такую длину прядок.

Роскошные длинные локоны — настоящий холст для грамотного парикмахера, они дают возможность вволю разгуляться фантазии, выполнить красивое мелирование, которое заставит шевелюру заиграть массой новых оттенковМелирование является лучшим вариантом окрашивания длинных локонов, так как захватывает не всю шевелюру, соответственно, ваши локоны куда меньше подвержены вредному воздействиюМелирование длинных прядок придает локонам объем, скрывает мелкие недостатки стрижки, в целом делает лицо моложе, привлекательнее, ярче

Мелирование является лучшим вариантом окрашивания длинных локонов, так как захватывает не всю шевелюру, соответственно, ваши локоны куда меньше подвержены вредному воздействию. К тому же, мелирование способно полностью изменить образ, при этом не подвергаясь глобальным изменениям. Любая методика подходит к шевелюре средней длины и больше, но лучше всего на длинных прядях смотрятся такие техники частичного окрашивания, как классическое, калифорнийское и мажимеш, то есть французское, а также омбре. Мелирование длинных прядок придает локонам объем, скрывает мелкие недостатки стрижки, в целом делает лицо моложе, привлекательнее, ярче.

Красивая игра цветов на светлых волосахМодные оттенки пепельного цветаТонкие светлые пряди на темных волосах придают глубины прическе

Совет! Если у вас темные волосы, то подойдите к вопросу очень ответственно, так как мелирование на темные оттенки выполняется куда сложнее, чем на светлые, соответственно, огрехи в таком окрашивании сложнее исправлять. А если ваша шевелюра сильно подвержена истощению и ломкости, локоны находятся в плохом состоянии, то выбирайте мажимеш или балаяж как наиболее щадящие способы окраски.

Оригинальное окрашивание коротких волос

Не все счастье досталось длинноволосым девушкам, осталось кое-что и на долю девушек с короткими стрижками. Короткая стрижка сложнее поддается мелированию, в окрашивании коротких прядей есть множество своих нюансов, однако, существует несколько вариаций частичного окрашивания, которые подходят только для коротких волос и не будут смотреться на длинной шевелюре. В свою очередь, стандартные техники окрашивания типа омбре невозможны на коротких стрижках, так как недостаточная длина прядей не дает раскрыться переливам цвета, которые предполагают такие типы частичного окрашивания. Итак, способы мелирования для красавиц с короткими стрижками:

  • Мелирование яркими цветами — такой способ частичного окрашивания, при котором лишь несколько прядок окрашиваются в контрастные основному цвету тона.
Окантовка стрижки с помощью мелированияДля коротких волос подходит мелирование яркими цветами — такой способ частичного окрашивания, при котором лишь несколько прядок окрашиваются в контрастные основному цвету тонаЯркое мелирование на коротких волосах
  • Мелирование двумя тонам и более. Цвета могут быть как контрастными, так и схожими между собой. Такая техника также выполняется лишь на небольшом количестве прядок.
  • Стиль пикабу — окрашивание небольшой нижней части волос в контрастно-темный оттенок. Придает прическе объем и подчеркивает черты лица.

Совет! Обладательницам строгих или асимметричных коротких стрижек следует воздержаться от частичноой покраски, так как оно способно испортить линии прически, для такого типа причесок следует выбрать полное окрашивание.

Переход от темно-розового к светлому у кончиковСтиль пикабу — окрашивание небольшой нижней части волос в контрастно-темный оттенок. Придает прическе объем и подчеркивает черты лицаМелирование на челкеКлассическое мелирование на стрижке каре

Модный колор

Традиционные типы частичного окрашивания — как классическое, так и зональное, предполагают окрашивание отдельных прядок в различные цвета как контрастные основному, так и схожие с ним.

Лучше всего окрашивание традиционно ложится на волосы светлых оттенков. На светло-русых волосах хорошо смотрятся практически все техники мелирования, за редким исключением, как, например, шатуш. Оттенки краски для светлых локонов можно подобрать самые разнообразные, отлично будут смотреться чуть более темные и светлые оттенки русого цвета, контрастные темные прядки, как в брондировании, возможно даже мелирование яркими прядями, если вы не боитесь эпатировать публику.

Лучше всего окрашивание традиционно ложится на волосы светлых оттенков. На светло-русых волосах хорошо смотрятся практически все техники мелированияОттенки краски для светлых локонов можно подобрать самые разнообразные, отлично будут смотреться чуть более темные и светлые оттенки русого цветаМелирование на темно-русых локонах

Для темных локонов наиболее подходящие тона прядок — чуть более темные или светлые, чем основной цвет, разнообразная палитра каштановых, ореховых оттенков будет отлично смотреться на темных волосах. Но не менее выигрышно смотрится и контрастно-светлый цвет, создающий иллюзию солнца, запутавшегося в прядках. Однако такие техники мелирования следует применять при окрашивании кончиков, а не целых прядей, как, например, все тот же шатуш.

Мелирование прядками проводится по двум различным методикам. Пряди либо окрашиваются вертикально, что называется мажиконтраст, либо диагонально. При окрашивании мажиконтраст меняют цвет прядок по всей длине, начиная от корней, заканчивая кончиками, меняя ширину прядок и глубину цвета. При диагональном же типе частичного окрашивания волосы окрашиваются в несколько произвольном порядке, в нескольких направлениях. Например, окрашивается только часть шевелюры, только кончики локонов, только верхний слой волос.

Для темных локонов наиболее подходящие тона прядок — чуть более темные или светлые, чем основной цвет, разнообразная палитра каштановых, ореховых оттенков будет отлично смотреться на темных волосахВыигрышно смотрится и контрастно-светлый цвет, создающий иллюзию солнца, запутавшегося в прядках

Совет! Выбирая способ окраски прядок, всегда ориентируйтесь на тип лица, украсит ли именно ваш типаж подобное окрашивание, не подчеркнет ли недостатки.

Интересные цвета для светлых волос

Наиболее подходящими цветами, способными оживить светлые волосы, придать им большей яркости, красоты, выразительности всему облику и образу, являются все оттенки светлого, которые, так или иначе, будут перекликаться с естественным, натуральным цветом вашей шевелюры. При выборе оттенка мелирования следует обращать внимание на теплоту тона. Девушкам с холодным светлым цветом шевелюры следует выбрать серебристые цвета, яркие оттенки светлого, также холодные светлые тона. Золотоволосым же красавицам следует отдать предпочтение таким же теплым тонам, которые красиво подчеркнут естественный цвет.

Наиболее подходящими цветами, способными оживить светлые волосы, придать им большей яркости, красоты, выразительности всему облику и образу, являются все оттенки светлогоДевушкам с холодным светлым цветом шевелюры следует выбрать серебристые цвета, яркие оттенки светлого, также холодные светлые тонаЗолотоволосым же красавицам следует отдать предпочтение таким же теплым тонам, которые красиво подчеркнут естественный цвет

Как правило, девушки, обладающие светлым цветом от природы, ценят такой подарок судьбы и не хотят кардинально меняться. Именно поэтому для блондинок замечательно подходят такие технологии, как мажимеш или калифорнийское окрашивание, которые подчеркивают глубину светлого, создают плавный переход от оттенка к оттенку, что придает прическе больше естественности, ухоженности.

Совет! Разнообразное сочетание светлых оттенков способно выгодно освежить лицо. Выбирайте для мелирования несколько тонов, для того чтобы прическа буквально заиграла новыми красками.

Для блондинок замечательно подходят такие технологии, как мажимеш или калифорнийское окрашивание, которые подчеркивают глубину светлого, создают плавный переход от оттенка к оттенкуМелирование светлых волос светлыми прядямиКалифорнийское мелирование на светло-русых локонахПлавный переход от более темных корней к светлым кончикам

Мелирование темных локонов

Ограничений в выборе оттенка краски для темноволосых красавиц фактически и не существует. Главное — это не забывать о том, что окрашивание темных локонов производится сложнее, чем светлых волос, учитывайте этот факт при выборе краски. А также не забывайте, что процедура частичного окрашивания может занять несколько часов, а после локоны потребуют еще более тщательного ухода, чем прежде.

Ограничений в выборе оттенка краски для темноволосых красавиц фактически и не существуетГлавное — это не забывать о том, что окрашивание темных локонов производится сложнее, чем светлых волос, учитывайте этот факт при выборе краскиПосле покраски волосы требуют еще более тщательного ухода, чем прежде

Наиболее удачные цвета для окрашивания на темные локоны — это классические темные оттенки, которые никогда не выйдут из моды. К ним относятся карамель, корица, каштан, кофе, шоколадные цвета. Все темные тона отлично сочетаются друг с другом, создавая красивый перелив на волосах и перекликаясь от прядки к прядке.

Тон, правильно подобранный исходя из натурального цвета волос, способен прямо-таки заиграть на темной шевелюре. Выполняется мелирование и светлой краской, однако, к такому окрашиванию необходимо подходить осторожно и тщательно. При грамотном окрашивании выглядеть темные волосы будут невероятно эффектно, светлые кончики придадут яркости, четкости линий, эффект градуировки сделает из вас настоящую красавицу.

Наиболее удачные цвета для окрашивания на темные локоны — это классические темные оттенки, которые никогда не выйдут из моды. К ним относятся карамель, корица, каштан, кофе, шоколадные цветаТон, правильно подобранный исходя из натурального цвета волос, способен прямо-таки заиграть на темной шевелюре

Совет! Подобрать максимально подходящий цвет для окрашивания просто — он должен быть на 2-3 тона светлее, чем натуральный цвет волос.

Тонкости частичного окрашивания

Мелирование — замечательная процедура, призванная без особого ущерба для состояния и здоровья волос, изменить ваш облик, сменить надоевшую прическу, стать более яркой и привлекательной. Однако не следует забывать, что при всех новейших щадящих методиках, окрашивание было и остается окрашиванием, процедурой, которая требует восстановления, ухода и поддержки.

Мелирование — замечательная процедура, призванная без особого ущерба для состояния и здоровья волос, изменить ваш облик, сменить надоевшую прическу, стать более яркой и привлекательнойСуществует целая линейка средств по уходу за волосами, подвергшимися окрашиванию, которая позволит сохранить ваши волосы здоровыми, поддержать яркость цвета, уменьшить риск травмирования волос

Для того чтобы красивые, аккуратно окрашенные прядки продолжали радовать глаз постоянно, необходимо постоянно обращаться в салон или парикмахерскую для коррекции цвета, так как волосы отрастают, а краска смывается. К тому же существует целая линейка средств по уходу за волосами, подвергшимися окрашиванию, которая позволит сохранить ваши волосы здоровыми, поддержать яркость цвета, уменьшить риск травмирования волос.

Совет! Перед проведением частичного окрашивания необходимо привести волосы в порядок, вылечить, если это требуется, отстричь посеченные и мертвые кончики, восстановить структуру локонов, иначе вы рискуете получить совсем не тот результат, на который рассчитывали.

avrorra.com>

Оригинальные виды мелирования на короткие волосы

Мелирование на короткие волосы – это быстрый способ придать стрижке особое очарование и красоту. Сегодня мы поговорим об особенностях мелирования и его видах. А также покажем на фото, как можно с помощью такого способа полностью преобразить простую короткую стрижку.

Особенности окрашивания коротких волос

Короткая стрижка способна не только омолодить женщину, но и добавить в ее образ нотки элегантности. Сегодня короткие прически пользуются популярностью и среди молодых девушек, и среди зрелых дам. Однако такие волосы, как правило, не предполагают широкого выбора разнообразных укладок и причесок.

Если же вы желаете кардинально изменить свой внешний вид, то прекрасным выбором станет мелирование на короткие волосы. С помощью такого окрашивания можно создать оригинальный образ, а также подчеркнуть все достоинства внешности и скрыть ее недостатки (например, замаскировать седину).

Процедуру мелирования рекомендуется проводить исключительно в парикмахерских. Дело в том, что этот процесс требует опыта и внимательности при подборе цветового оттенка и зон для окрашивания. Сегодня стилисты не ограничивают модниц в выборе тона для отдельных прядей: это могут быть как светлые классические оттенки, так и яркие оригинальные цвета. Для девушек с темным цветом волос можно подбирать холодные светлые тона, либо яркие теплые оттенки. А вот женщинам со светлыми локонами можно поэкспериментировать, добавив в образ мягкие темные цвета. Стильные и необычные образы с разными видами мелирования представлены на фото ниже.

Рассмотрим основные достоинства мелирования коротких прядей:

  1. В отличие от стандартного однотонного окрашивания, такая техника позволяет создать эффект плавного перетекания оттенков. Если вы желаете, чтобы ваш цвет выглядел более натуральным, окрашивать следует тонкие пряди.
  2. Заметная разница между окрашенными и натуральными локонами проявляется немного позже, нежели после полного окрашивания, поэтому процедуру мелирования нужно повторять значительно реже.
  3. Такая процедура меньше вредит локонам, в отличие от полного окрашивания, так как химическому воздействию поддаются только отдельные пряди, а не вся шевелюра.
  4. Мелирование подчеркнет яркость и индивидуальность каждой девушки! С помощью такой техники можно кардинально изменить образ, добавить в него новые краски и акценты.

Выбирая вид окрашивания, следует обратить внимание на то, что девушкам с каре или стрижкой боб  не подойдет классическое мелирование.

Стилисты рекомендуют выбирать более «сдержанные» и оригинальные варианты: калифорнийский, американский, венецианский, балаяж, мажимеш, мажиконтраст и другие. Далее мы рассмотрим разнообразные вариации этой техники подробнее.

Калифорнийское мелирование

Такая техника окрашивания в 2016 году будет на пике популярности. Хотя и до этого калифорнийское мелирование особенно было востребованным среди модниц и голливудских знаменитостей.

Такая процедура позволяет добиться эффекта плавного перехода от темных корней к осветленным вертикальным прядкам. Кроме того, во время процедуры волосы поддаются минимальному химическому воздействию (так как во время работы мастер не использует фольгу).

В отличие от похожей техники шатуш, калифорнийский вариант можно выполнить на коротких прядях. Если процедура выполнена правильно, то полученный цвет будет идеально гармонировать с натуральным оттенком локонов.

Кроме того, калифорнийское мелирование может быть исполнено в различных вариантах: пряди могут быть как тонкими, так и широкими, окрашивание может начинаться почти от самых корней или от середины волос. Самые интересные и стильные варианты калифорнийского мелирования на коротких волосах представлены ниже на фото.

Американское

Американская техника окрашивания прядей позволяет добиться  эффекта «солнечных бликов» на локонах. С помощью такой процедуры можно оживить образ, сделать его более ярким и заметным.

Следует отметить, что изначально американское мелирование предполагало хаотичное окрашивание прядей в яркие оттенки красного: бордовый, коричневый, рыжий или оранжевый. Сегодня использование экстравагантных цветов при американском мелировании необязательно.

Такая техника предполагает разноцветное окрашивание. При работе с волосами мастер может использовать от 3 до 5 разных оттенков.

Американское мелирование – выбор ярких и смелых девушек. Современные стилисты постоянно экспериментируют с окрашиванием прядей в такой технике, выбирая самые разнообразные яркие оттенки (зеленый, синий, фиолетовый, желтый). На фото ниже вы можете увидеть яркие и запоминающие образы на коротких волосах.

Венецианское

Венецианское мелирование по своей технике напоминает калифорнийское. Отличие лишь в том, что первый вариант возможен лишь на темных локонах.

Венецианская техника окрашивания прядей предполагает создание эффекта выгоревших волос, благодаря чему они смотрятся очень стильно и естественно.

Такая техника окрашивания пользуется особой популярностью среди звезд Голливуда. Ярким примером этого являются образы Анджелины Джоли, Дженифер Лопес, Джессики Альбы. Интересный вариант венецианского окрашивания представлен ниже на фото.

Балаяж

Балаяж – это зональное осветление волос. Техника балаяж предполагает окрашивание в светлые оттенки отдельных частей волос, например, затылочной зоны, висков или челки. Такая прическа будет стильно смотреться на дамах любого возраста и подчеркнет индивидуальность каждой.

Техника балаяж незаменима, если вы решили кардинально изменить свой внешний облик (например, перекрасится из блондинки в яркую брюнетку). «Вытягивание» цвета до близкого к натуральному оттенка поможет создать плавный переход, а образ получится еще более ярким и оригинальным.

Существенным преимуществом техники балаяж являет возможность применить ее и к длинным, и к коротким прядям. Кроме того, при процедуре не используется фольга, что позволяет значительно снизить риск химического повреждения волос.

Оригинальные образы с применением техники балаяж вы можете увидеть на фото ниже.

Мажимеш

Мажимеш – это техника окрашивания светлых локонов, с помощью которой отдельные пряди высветляются. Существенным плюсом такого мелирования является то, что при работе с локонами мастер использует специальный состав без аммиака. Это позволяет минимизировать повреждение локонов во время процедуры.

Техника межимеш используется для создания эффекта выгоревших волос и на коротких, и на длинных прядях. Результат окрашивания  в такой технике вы можете увидеть на фото ниже.

Мажиконтраст

Мажиконтраст – яркое и оригинальное сочетание контрастных прядей. Такое мелирование особенно стильно и экстравагантно смотрится на девушках с короткой стрижкой.

Мажиконтраст – прекрасный выбор для женщин, которые не боятся оказаться в центре внимания. Окрашивание волос в такой технике предполагает использование самых неожиданных оттенков, а также сочетание натуральных темных волос с высветленными яркими прядями.

Следует отметить, при работе с волосами в технике мажиконтраст мастера, как правило, используют сильные осветлители и стойкие красители, поэтому такая процедура может существенно навредить локонам.

Разнообразные образы, выполнение в технике мажиконстраст, представлены на фото ниже.

Диагональное мелирование

Диагональное мелирование – это оригинальный способ подчеркнуть красоту натурального оттенка волос благодаря ярким контрастам. В зависимости от предпочтений девушки, мастер может окрасить пряди в один или несколько оттенков. Самые стильные и оригинальные варианты окрашивания отдельных локонов вы можете увидеть на фото ниже.

Мелирование коротких волос (фото)

TvoiLokony.ru>

Окрашивание волос омбре (39 фото): очаруйте окружающих модным и стильным образом

Окрашивание Ombre Hair Color  находится на пике своей популярности, и похоже, обороты сбавляться не будут. Появляется всё больше разновидностей данной техники, а это значит, что любая модница сможет подобрать нужный вариант, который не будет зависеть от исходного цвета шевелюры и её длины.

Объяснить причину такой популярности сложно, но, скорее всего, всё кроется в том, что в данном случае отпадает необходимость обязательного окрашивания волос полностью. При этом таким способом вносится изюминка к привычному всем образу. И если девушка побаивается кардинальных перемен, то омбре  — именно то, что ей нужно.

Похоже, омбре ещё долго будет лидировать среди других распространённых окрашивающих техник

Многообразие видов омбре

Звёзды шоу-бизнеса также облюбовали данную технику

Виды окрашивания волос омбре зависят от исходного цвета и длины шевелюры:

  • двутональное — классическое;
  • многотональное;
  • брондирование;
  • с акцентированием цвета на темных прядях;
  • натуральное на темные локоны;
  • хайлайтинг на светлых волосах;
  • придание контуров стрижке;
  • английское окрашивание Brond-ombre;
  • окрашивание частями и асимметрией;
  • скандинавское;
  • для блондинок.

Существуют также и другие разновидности.

Всё о классическом двутональном омбре

Модное окрашивание волос 2014 омбре – классический двутональный вариант. Суть в том, что имеется горизонтальная граница плавного и мягкого перехода цвета.

Отлично «ложится» такое омбре на темные окрашенные волосы, где корень останется затемнённым, а концы осветляют  и тонируют соответственно основному цвету. Особенно впечатляюще всё выглядит на длинных прядях, где хорошо просматривается вся плавность перехода цвета.

То, какие будут использоваться оттенки для тонирования, во многом зависит от исходного цвета, а также от типа внешности. Чаще всего применяются натуральные тона, к примеру, шоколадные, русые, пшеничные, кофейные, медовые и др. Главное, чтобы цвета в паре  отлично сочетались между собой.

Фото: результат выполнения классического омбре

Сложное многотональное окрашивание

Мультитональная техника окрашивания волос омбре выглядит просто сногсшибательно, особенно если вы обладательница длинной шевелюры. Для максимально плавного перехода мастер использует несколько промежуточных оттенков. Здесь может использоваться широчайшая палитра цветов — порой для одной покраски может использоваться даже десять оттенков.

Многотональное окрашивание – техника, которая очень сложна в исполнении. В работе требуются знания в подборе оттенков, умение их сочетать, а также  усвоение всех нюансов выполнения покраски. Также существует чёткая инструкция по выполнению работы, нарушение которой приведет к печальным последствиям.

Обратите внимание! Если вы решили выполнить такую непростую технику своими руками, лучше откажитесь от такой затеи, поскольку,  не имея опыта и профессиональной подготовки, вряд ли вам удастся достигнуть максимально привлекательного эффекта. Лучше доверьте свою шевелюру рукам профессионалов.

Креативный подход к окрашиванию

Окрашивание волос в стиле омбре может выполняться в контрастных и ярких цветах. Если вы харизматичная, яркая и смелая личность, которая любит быть в центре внимания и поражать нестандартным внешним видом, тогда креативное омбре – вариант именно для вас.

Придайте яркости и контраста своему образу с помощью необычного сочетания смелых цветов

Здесь можно воплотить в жизнь все ваши идеи, используя самые смелые цвета. Подбор оттенков во многом зависит от стиля жизни, гардероба, а также индивидуальных предпочтений.

Замечательно выглядят следующие сочетания и эффекты:

  • Придадут изюминки чёрным локонам насыщенные синие концы. Также разнообразит образ дополнительно введённый малиновый тон.
  • Хорошо смотрится сочетание исходных каштановых и чёрных прядей с лиловыми, сиреневыми, синими, розовыми и цикламеновыми оттенками.
  • Актуально также создание плавного горизонтального перехода с помощью вышеперечисленных тонов.
  • Можно реализовать и акцентирование отдельных прядей с помощью ярких и насыщенных цветов.  Таким образом получится замечательно подчеркнуть каскадную стрижку.

  Обратите внимание! Поскольку креативное омбре привлекает к себе много внимания, вам следует позаботиться о состоянии шевелюры. Совершенно «невнятно» будут выглядеть яркие цвета на секущихся, ломких и сухих прядях. Поэтому, решив сделать данный тип омбре, займитесь оздоровлением волосяного покрова.

Омбре — брондирование

Тёмные локоны — замечательная почва для брондирования

Среди особенностей бронд-омбре выделяют следующие:

  • корень тёмного натурального цвета;
  • основная масса волос поддаётся осветлению в натуральные оттенки по технике брондирования, но это не касается прикорневой зоны.
  • подходит, на тёмные, чёрные и русые пряди.
  • Использование нескольких оттенков, с помощью которых создаётся богатый эффект.
  • В основном прикорневая часть поддаётся окраске в кофейные, каштановые, темно-коричневые, шоколадные цвета.
  • Затемнённая часть имеет длину в 7-10 см, порой она достигает линии края скул.
Хайлайтинг на светлые прядки

Всем желающим провести окрашивание омбре на светлые волосы, стилисты рекомендуют сделать хайлайтинг. Такой способ заключается в лёгком и натуральном подсвечивании прядей, благодаря чему шевелюра наполняется необыкновенными переливами.

С окрашиванием шатуш вы будете выглядеть, будто только вернулись с солнечного пляжа

Выполняется хайлайтинг двумя способами:

  • Шатуш волос. Цвет растушевывается мягко и плавно.
  • Калифорнийское мелирование волос. Прикорневая зона затемнена. Осветлённые локоны расположены хаотичным образом, за счёт чего выглядят они выгоревшими на солнце.
Скандинавская разновидность

Подойдёт данная разновидность омбре на окрашенные волосы, вернее, осветлённые.

Обладательницы платиново-белой шевелюры смогут придать образу ярких акцентов с помощью следующих сочетаний:

Платиновые блондинки могут экспериментировать, окрашивая кончики в смелые цвета

  • Кипельному-белому блонду подойдёт бледно-сиреневый цвет.
  • Придаст оживлённости образу сочетание блонда с малиновыми, цикламеновыми, красно-коралловыми оттенками.
  • Хорошо смотрится и плавный переход от светлых корней к тёмным кончикам, которые могут быть окрашены в темно-коричневый либо черный цвет. Это классическое скандинавское омбре.

Скандинавское омбре

Окрашивание тёмной шевелюры

Окрашивание омбре на темные волосы – беспроигрышный вариант, поскольку такая шевелюра является замечательной основой для работы в различных техниках. Всегда на высоте вы будете выглядеть  как с контрастным омбре, так и с отросшим эффектом бронд.

А благодаря сочетанию множества цветов  образ может в результате выйти умопомрачительным:

  • Брюнеткам будет к лицу коньячное, карамельное или медовое омбре.
  • Подчеркнёт глубокие тёмные локоны оттенок золотистого каштана, кофейный, медовый, карамельный, коньячный.
Покраска рыжих прядей

Восхитительно выглядит данное окрашивание и на рыжеволосых красавицах.

Нижеприведённые сочетания используются чаще всего:

Воспламените огонь  с помощью яркого рыжего омбре

  • Тёмно-рыжая прикорневая часть + чёрные кончики.
  • Чёрные корни + огненно-рыжие концы.
  • Огненно-рыжие корни + светло-коричневые кончики.
  • Медовые корни + мандариновые кончики.

Заключение

Подводя итоги, хотим отметить, что Ombre Hair Color – причёска, которая придаст необычности вашему образу.  Плавность либо резкость переходов, натуральность либо яркий контраст – выбирать только вам.

И хоть процедура очень сложна, требует терпения и длительного времени для исполнения, столь высокая цена платится за очаровательный, благородный и роскошный вид.

Видео в этой статье наглядным образом продемонстрирует, как происходит процедура окрашивания.

shpilki.net>

Похожие статьи

Двойное окрашивание волос: описание с фото, выбор краски для волос, техника окрашивания, особенности и нюансы ухода за волосами после окраски

Современные представительницы прекрасного пола внимательно следят за всеми модными тенденциями. Желание выглядеть всегда хорошо имеется у каждой красавицы. При этом регулярно возникает желание что-то слегка изменить в себе, не делая слишком кардинальных перемен. Изменение стрижки или цвета волос – это первое к чему прибегают женщины. На пике популярности двойное окрашивание волос. Оно позволяет добиться быстрого и всегда удачного изменения образа. Существует масса методик и новейших технологий, позволяющих преобразиться даже самой заурядной личности. В нашей статье мы хотим более подробно остановиться на двойном окрашивании волос, чтобы читатели смогли ознакомиться с последними модными тенденциями.

Преимущества сочетания цветов

Окрашивание волос давно стало самым простым способом изменения внешности. Самые отчаянные девушки не боятся смелых экспериментов и регулярно меняют цвет. Но столь экстравагантное поведение не всем по душе. Многие женщины мечтают более спокойных изменений, чтобы подчеркнуть свою индивидуальность. Двойное окрашивание волос давно полюбилось звездам, которые не перестают идти даже на самые смелые эксперименты. Наблюдая за своими кумирами, мы в свою очередь пытаемся сделать свои прически максимально похожими. Однотонный цвет давно всем наскучил и не вызывает восторга.

А вот двойное окрашивание придает представительницам прекрасного пола очарования, оно делает женщин более привлекательными и интересными. На сегодняшний день существует масса методик, благодаря которым можно добиться потрясающих результатов. Однако для не посвященных в данный вопрос людей, сложно увидеть какую-либо разницу между ними. Именно по этой причине мы хотим уделить внимание двойному окрашиванию. Владея информацией, вы сможете с уверенность рассказать парикмахеру или стилисту, какие изменения в прическе вы хотите получить.

Кому можно использовать несколько цветов для покраски?

Очень часто брюнетки мечтают стать блондинками, а блондинки — брюнетками. Другие просто внести яркий акцент в свою внешность. Все эти изменения способно привнести в образ двойное окрашивание волос, не заставляя делать обладательницу шевелюры кардинальных перемен.

Небольшое изменение цвета можно проводить на натуральных волосах, добавив неяркие оттенки: пшеничный, медовый, русый, кофейный, шоколадный. Не менее эффектно смотрятся и более яркие акценты – розовый, синий, белый. Все зависит от того, какой образ вы хотите получить.

Двойное окрашивание волос можно выполнить по всему объему, на отдельных прядях, на челке, кончиках и т. д. Вариантов предложить можно невероятно много.

Специалисты утверждают, что противопоказаний к такому окрашиванию не может быть. Любая девушка с любым типом волос может себе позволить новый стиль. Конечно же, каждая техника выполнения покраски имеет свои особенности. Поэтому для каждого конкретного случая выбирается своя методика.

Не рекомендуется окрашивание лишь в том случае, если у вас имеется аллергическая реакция на красители или существенные повреждения волос. Перед экспериментами следует состричь посеченные кончики и подлечить шевелюру.

Также не следует красить волосы в периоды гормональных изменений в организме: во время беременности, приеме лекарств, кормлении грудью. Во всех иных случаях можно приступать к экспериментам. Окрашивание поможет:

  1. Сделать прическу более яркой и выразительной.
  2. Обновить внешний вид: слегка или кардинально.
  3. Придать блеска шевелюре.
  4. Оттенить натуральный цвет или дать возможность ему заиграть новыми оттенками, а также притушить ненужные цвета, возникшие при неправильной покраске.

Преимущества техник

Двойное окрашивание позволит:

  1. Зрительно увеличить объем.
  2. Сменить имидж.
  3. Обновить цвет.
  4. Добавить сияние и блеск.
  5. Откорректировать форму лица.
  6. Нет необходимости производить регулярную коррекцию. Эффект после процедуры может наблюдаться до 3-4 месяцев.

Недостатки покраски

Несмотря на все достоинства окрашивания в два цвета, имеются и некоторые недостатки:

  1. Высокая стоимость в салонах.
  2. Шатенкам и брюнеткам всегда требуется дополнительное осветление, иначе не получиться добиться нужного эффекта.
  3. Окрашенные волосы нуждаются в регулярной укладке, чтобы вид у них был эффектный.
  4. Тщательный уход за окрашенными волосами.
  5. Получив яркие оттенки при покраске сложно вернуться к прежнему цвету.
  6. Некоторые способы покраски не просто воспроизвести в домашних условиях.

Кому подходит балаяж?

Двойное окрашивание на короткие волосы (фото приведено в статье) можно выполнить при помощи техники балаяж. Подходит она и для шевелюры средней длины. Техника подразумевает прокрашивание только кончиков, поэтому на длинных волосах результат будет не столь впечатляющим. Такой вариант настоящее спасение для девушек с редкой и тонкой шевелюрой. Даже самым жидким волосам двойное окрашивание (фото приведено в статье) придаст объем, а прическа будет переливаться в солнечных лучах.

Техника выполнения

Создать самостоятельно балаяж на короткие волосы не так уж и трудно в домашних условиях. А вот двойное окрашивание на волосы средней длины лучше доверить профессионалам.

Перед началом процедуры волосы распределяют на пряди, в результате чего на голове образуются квадратики. Их фиксируют резинками, чтобы они не распались в процессе. Затем разводят осветляющую краску и наносят ее на кончики. Окрашивать волосы необходимо аккуратно, чтобы не задеть корни. Кончики оборачивают фольгой для получения лучшего эффекта.

В том случае, если у вас короткая стрижка, балаяж делается немного иначе. Вначале волосы сильно начесывают, чтобы они торчали в разные стороны. Для тонких волос, которые невозможно начесать, можно порекомендовать использование сильно фиксирующего лака. Далее формируем отдельные пряди и прокрашиваем кончики, не забыв завернуть их фольгой. Профессиональные парикмахеры выкладывают каждый локон на бумагу и прокрашивают, после чего сворачивают ее. Такой вариант покраски подходит также обладательницам многоуровневых стрижек.

Омбре

Уже давно у девушек пользуется популярностью омбре. Идеально двойное окрашивание смотрится на темных волосах. Техника сочетания двух разных контрастных оттенков может быть использована для женщин разных возрастов. Креативное решение позволяет создать элегантный образ. Такой способ прокраски можно увидеть среди таких звезд как Дженнифер Энистон, Кристина Агилера, Дженнифер Лопес.

Омбре – это техника, которая не имеет ограничений по длине шевелюры. Двойное окрашивание на средних волосах или длинных смотрится одинакового хорошо. Яркое омбре очень эффектно выглядит на длинных локонах. А вот на коротких волосах техника позволяет создать загадочный и воздушный образ.

Техника выполнения омбре

Двойное окрашивание (фото приведено в статье) идеально выглядит на темных волосах. Для этого используют краску одного цвета, но разных оттенков. Но можно подобрать и совершенно разные, но при этом сочетаемые цвета. Например, черный отлично смотрится с рыжим, красным, фиолетовым и белым. Главный принцип омбре – это создание вида отращенных корней, словно их давно не прокрашивали.

При использовании техники необходимо красить все волосы. Корни и еще двадцать сантиметров от них (если речь идет о длинной шевелюре) нужно прокрасить в темный цвет. Оставшиеся волосы делают более светлыми. Переход между оттенками должен быть очень плавным и незаметным.

Дуальное окрашивание

Одним из новых веяний является дуальная техника окрашивания волос. Уже само название говорит о том, что используется два тона. Но при этом переход от темного к светлому оттенку выглядит максимально естественно. Для того чтобы добиться такого эффекта, мастер на прикорневую зону наносит краску с минимальным количеством окислителя, после увеличивает его концентрацию по мере продвижения к кончикам.

Специалисты говорят о том, что дуальное окрашивание можно назвать одним из видов брондирования, при котором используются разные оттенки одного цвета. Такая техника позволяет не только создавать плавные переходы, но и блики на шевелюре.

Брондирование

Люди, далекие от парикмахерского дела, вряд ли разбираются в том, как называется двойное окрашивание волос. Тем более, что разновидностей техник существует достаточно много. Одной из них является брондирование. Само название в точности отражает получаемый результат. Термин произошел от двух английских слов «светлый» и «коричневый». Методика основана на использовании только этих двух цветов. Двойное окрашивание смотрится очень натурально. Внешне создается впечатление, что волосы немного выгорели на солнышке. Эффект смешения расплавленного меда и золота просто потрясающий. Локоны сияют на солнце, а сама прическа выглядит более объемной.

Брондирование – это одна из самых сложных техник. Подобное окрашивание может выполнить только опытный мастер. Прокраситься в домашних условиях самостоятельно не получиться.

Методика брондирования подразумевает распределение всех локонов на светлые и темные по схеме. А затем мастер подбирает идеальное сочетание оттенков для каждого человека отдельно, учитывая тип лица, цвет глаз и кожи, длину локонов и прочие факторы. В случае необходимости мастер может подкорректировать прическу, чтобы двойное окрашивание выглядело максимально эффектно.

Американское колорирование

Американское колорирование – это тоже двойное окрашивание волос. На средних волосах оно смотрится также хорошо, как и на коротких. Техника получила название из-за невероятной ее популярности среди американских рок и панк-звезд, которые всегда выглядят потрясающе ярко.

Суть окрашивания состоит в том, что мастер отбирает в основной массе волос одной или нескольких прядок, которые прокрашиваются в яркий цвет: синий, красный, фиолетовый, зеленый и другие. Американское колорирование смотрится хорошо на любой длине волос. Если ваш натуральный цвет волос темный, то перед окрашиванием прядь необходимо предварительно осветлить. Американское колорирование можно легко сделать самостоятельно. Если вы решитесь на дерзкий эксперимент, стоит обратить внимание на самые яркие оттенки: рыжий, красный, синий, фиолетовый, пурпурный, зеленый, розовый. Эти цвета сейчас на пике популярности.

Деграде

Еще один вариант двойного окрашивания – деграде. Его можно выполнять на волосах любой длины. Преимущество метода состоит в том, что прокрашенная шевелюра будет переливаться на солнышке. При этом прическа выглядит очень натурально и объемно.

Для покраски понадобится две пачки краски одного цвета, но разных оттенков (с разницей в 2-3 тона). Волосы прокрашивают по всей длине, чередуя пряди. Технология очень проста, поэтому ее можно использовать дома. Если вы хотите получить едва заметный эффект, то необходимо выбирать краску с разницей в два тона. Для более яркого результата нужно использовать более контрастные оттенки.

Для самостоятельного окрашивания необходимо верхние пряди отделить от нижних, после чего заколоть их на макушке. Далее на нижнюю часть наносят более светлую краску. Через определенное время ее смывают. Затем окрашивают верхние пряди. После промывают все волосы. Как видите, методика очень проста.

Уход за волосами

Какими бы стойкими красками вас не окрашивали, со временем они смываются и тускнеют. Поэтому волосы нуждаются в уходе. В первые сутки необходимо нанести на влажные волосы закрепляющий бальзам. Если вы пользуетесь услугами салона, то мастер сделает это самостоятельно. Пигмент закрепляется в волосах в течение первых двух суток, поэтому в это время желательно не мыть голову. Не стоит расчесывать мокрую шевелюру, это может навредить ей.

Любое окрашивание повреждает волосы, поэтому рекомендуется регулярно использовать специальные маски и бальзамы, их можно приобрести в любом магазине. В помощь придут и домашние средства: кефирная маска, горчичная, различные масла.

Двухцветное окрашивание волос: фото, техника и отзывы

Смена имиджа, как правило, сопровождается сменой прически и окрашиванием волос. Смелые перевоплощения из нежной блондинки в жгучую брюнетку или рыжеволосую красавицу порядком поднадоели, и милые прелестницы ищут новые варианты сменить надоевший образ. Известные стилисты каждый год предлагают свежие идеи для женского облика, и одна из них – двухцветное окрашивание волос. В нашем небольшом обзоре мы постараемся как можно подробнее рассказать о всех тонкостях этого получившего огромное распространение метода.

Окраска волос в два цвета. Общие понятия

Окраска волос в два цвета применяется не так давно, но насчитывает много способов и техник исполнения. На самом деле здесь нет ничего сложного: либо волосы окрашивают в два цвета, либо некоторые пряди осветляют, чтобы сделать эффектный переход от более темного колера к светлому. Но суть метода одна – локоны всегда окрашены в два тона, причем цвета могут быть как повседневными, так и очень смелыми (розовыми, фиолетовыми, синими, голубыми, желтыми и т. д.). Яркий оттенок может отлично гармонировать с натуральным цветом волос, а может сочетаться с другим таким же ярким оттенком.

В любом случае двухцветное окрашивание волос – очень серьезный эксперимент и ответственный шаг, а для того, чтобы получить красивый и желаемый результат, необходимо проконсультироваться у парикмахеров-профессионалов. Они помогут подобрать метод окрашивания, который подойдет именно вам, а также краски и оттеночные бальзамы, выгодно подчеркивающие цвет ваших глаз и кожи.

Способы нанесения краски на волосы

Модное двухцветное окрашивание волос может иметь много разных способов нанесения окрашивающего средства на пряди. Например, один цвет наносят на прикорневую зону, а вторым окрашивают остальную длину. Можно выделить другим цветом лишь кончики волос, а можно окрасить только несколько вертикальных прядей: полет фантазии здесь безграничный.

Хотелось бы отметить, что смелые и яркие сочетания цветов больше подойдут юным, а вот дамам постарше желательно остановиться на естественных тонах и более плавных переходах, без резких линий. Давно подмечено, что удачное осветление прядей возле лица может заметно сбавить возраст, а также омолодить и освежить лицо.

Некоторые преимущества

Двухцветное окрашивание волос вот уже несколько лет находится на самом гребне популярности. Хотя это достаточно сложный и трудоемкий в исполнении метод, у него есть несколько неоспоримых преимуществ перед окрашиванием в один тон, а именно:

  • Окраска волос двумя и более цветами подходит всем, независимо от возраста, внешности, цвета кожи, длины или густоты волос. Она вносит свежий ветер перемен в образ, делает женщину намного привлекательнее.
  • Обладательницам редкой шевелюры данный метод позволит зрительно сделать прическу более объемной благодаря натуральным цветам – их плавные переходы вызывают игру света и создают эффект объема.
  • Окрашивание только нескольких отдельных прядей значительно меньше наносит вреда волосам, чем при однотонной окраске всей шевелюры.
  • В дальнейшем поддерживать форму и корректировать цвет такой прически намного легче, чем при однотонном окрашивании. Особенно если выбраны натуральные цвета – отрастающие корни не слишком бросаются в глаза.

Разновидности двухцветного окрашивания

В этом разделе мы попытаемся разобраться, как называется двухцветное окрашивание волос, и рассмотрим основные варианты парикмахерского преображения.

1. Мелирование – считается самым распространенным и универсальным способом окрашивания. Подходит для любой длины волос и способно радикально изменить имидж. При мелировании окрашиваются только отдельные пряди волос – они могут быть толстыми или очень тонкими. Таким образом, прядки после окрашивания приобретают более светлый оттенок: медовый, бежевый, желтый или белый – в зависимости от выбранного цвета.

В салоне опытный мастер посоветует вам, какой ширины пряди лучше высветлить в зависимости от типа лица и формы прически; подберет цвет, который выигрышно подчеркнет достоинства.

Но следует помнить, что мелирование требует своевременной корректировки как прически, так и окрашенных локонов, так как отросшие корни будут слишком заметны.

2. Омбре – это способ окрашивания, при котором происходит плавный переход от темного цвета у корней к более светлому на кончиках, при этом создается эффект выгоревших волос. Такой метод окрашивания выглядит вполне естественно и очень оригинально.

Преимущество такой прически в том, что она длительное время не требует коррекции и подкрашивания, так как отросшие волосы не повлияют на ее внешний вид. Омбре с его мягкими переходами требует кропотливой и долгой работы настоящего мастера – для достижения более естественного результата приходится использовать не только осветлитель, но и несколько оттенков краски. Но конечный результат стоит того: окружающие думают, что обладательница роскошных выгоревших волос только что вернулась с моря – ведь только жаркое солнце и соленая морская вода способны создать такой эффект.

3. Окрашивание методом брондирования – новый способ, получивший распространение совсем недавно. Он получил свое название в результате смешения двух английских слов: «brown» и «blond» – «шатен» и «блондин». Для такого способа окрашивания используются оттенки только натуральных тонов, ведь конечная цель состоит в создании максимально естественного образа.

Золотистый шатен и натуральный мед, золото спелой пшеницы и солнечные блики – именно такой эффект и дает двухцветное окрашивание волос. Техника брондирования очень сложна в исполнении, так как для достижения результата мастер должен максимально четко распределить темные и светлые оттенки. И для каждой клиентки цвета подбираются индивидуально. Огромное преимущество брондирования состоит в том, что оно не требует частых коррекций цвета.

4. Балаяж волос. Метод в чем-то схож с омбре, но отличие состоит в том, что балаяж можно делать на любой длине волос, даже на очень коротких. Мастер старается создать эффект выгоревших волос почти от самых корней, в то время как при омбре этот эффект создается только на концах. При балаяже обычно светлым оттенком окрашиваются две трети длины волос на концах, а прикорневая зона остается натурального цвета. Этот метод идеально подойдет обладательницам редких волос, так как хаотичный переход цветов визуально добавляет объем прическе.

И на темных, и на светлых волосах балаяж выглядит потрясающе. Замечательно он смотрится и на русых локонах – высветленные пшеничные пряди и игру солнечных зайчиков дает двухцветное окрашивание волос. Фото стильных причесок методом балаяжа не оставят вас равнодушными.

Окрашивание коротких волос в два цвета

Стилисты в один голос рекомендуют колорировать короткие стрижки в два цвета, так как это решение сделает необычной любую прическу. Также немаловажен тот факт, что при двухтональном окрашивании прическа выглядит более объемной, а волосы – густыми. Двухцветное окрашивание коротких волос дает простор для фантазии – можно тонировать прическу в два слоя, можно окрасить лишь кончики или челку и т. д. При окраске коротких волос мастера придерживаются нескольких общих рекомендаций:

  1. Для длины волос ло плеч, а также причесок каре и боб наиболее выигрышно смотрится окраска волос методом омбре.
  2. Применение очень ярких и вызывающих оттенков помогает сделать короткую стрижку очень стильной.
  3. Применение темного оттенка на волосах скрытым методом позволяет сделать лицо визуально более вытянутым и худым.

Можно проявить фантазию и поэксперементировать с игрой цвета на волосах. Но в любом случае не стоит слепо копировать понравившийся образ, например из картинок в интернете – лучше проконсультироваться с опытным мастером. Тогда двухцветное окрашивание волос сможет внести свежий ветер перемен в ваш облик и подарить только положительные эмоции.

Окрашивание нижнего слоя волос (скрытое окрашивание)

Этот метод получил название скрытого, так как при этой технике подвергается тонированию только нижняя часть прически. Волосы могут окрашиваться в более темный и насыщенный цвет или, напротив, осветляться.

При окраске волос скрытым методом блондинкам нижнюю часть волос обычно тонируют в более темный или кричащий цвет, а верхняя часть в основном остается светлой. Русоволосым девушкам этот способ помогает добиться на волосах необычных и красивых переливов цвета.

Таким образом, при помощи удачного подбора цветов можно превратить даже самую унылую короткую стрижку в тренд.

Окраска темных волос в два цвета

Двухцветное окрашивание темных волос подходит всем без исключения и на любую длину локонов. Наиболее выигрышными вариантами для темных прядей будут методы балаяж и омбре. Сделав первый раз окрашивание, коррекцию у мастера можно повторить через месяц, а в дальнейшем освежать цвета раз в квартал, что значительно сэкономит время и деньги.

Двухцветное окрашивание светлых волос

Светловолосые барышни могут позволить себе намного больше экспериментов над своей шевелюрой, по сравнению с их темноволосыми конкурентками. Двухцветное окрашивание волос в домашних условиях с легкостью смогут сделать блондинки или светлорусые красавицы. Наиболее выигрышными методами для светлых волос являются мелирование, омбре и балаяж. Особенно эффектно и оригинально смотрятся выгоревшие локоны – для этого мастер-стилист наносит светлую краску на верхние пряди и на кончики.

Двойное окрашивание волос самостоятельно в домашних условиях

Красавицам, у которых уже есть опыт по смене имиджа у себя дома, можно порекомендовать и самостоятельное двухцветное окрашивание волос. Инструкция в этом случае довольна проста – достаточно придерживаться нескольких рекомендаций:

  • оттенки и цвета обязательно должны гармонировать с цветом глаз и кожи;
  • при работе в первую очередь наносятся светлые тона, а потом уж темные;
  • для естественного результата следует выбирать светлые и темные оттенки таким образом, чтобы они отличались не более чем на три тона от вашего натурального цвета волос.

Можно ли красить волосы два раза подряд

Бывают случаи, когда в результате неудачного подбора окрашивающих средств или в силу их низкого качества не получается достигнуть желаемого эффекта с первого раза. Тогда возникает необходимость повторной процедуры. Но специалисты крайне не рекомендуют проводить такое двойное окрашивание средствами, содержащими аммиак, так как это плохо влияет на структуру волос.

Повторное окрашивание можно сделать лишь в том случае, если для колорирования применялся оттеночный бальзам. Тогда краску для этой процедуры следует выбирать наиболее щадящую и с растительным составом.

Уход за окрашенными волосами

Так как при окраске волосы подвергаются вредному воздействию химических веществ, важно после процедуры тщательно за ними ухаживать. А помогут в этом специальные восстанавливающие бальзамы и маски для волос, которые без труда можно приобрести в магазинах косметики.

Комментарии для сайта Cackle

Модное окрашивание волос 2020: airtouch, рельефное, двойное

Окрашивание и тонирование преображают волосы. Они становятся плотнее, благодаря пигменту, и приобретают блеск. Если к перманентным красителям вы относитесь с негативом, попробуйте безаммиачные нейтральные красители и удивитесь как изменятся локоны. Главное выбирать качественные продукты, предназначенные для профессионального салонного использования. Поговорим какой цвет и модное окрашивание 2020 года выбрать.

Модное окрашивание Airtouch

Окрашивание Airtouch новый тип тонирования. Благодаря особой технике подготовки волос и нанесения красителя, цвет получается сложным и объемным. Перед тем как нанести краску, берут небольшую прядь и снизу продувают ее феном. Такой метод позволяет поднять маленькие волоски. Их отделяют от основной пряди, а ее прокрашивают. В большинстве случаев вначале применяется осветляющая паста. Затем локоны тонируют в нужный цвет.

Рельефное окрашивание

Сложный метод, в котором смешиваются несколько оттенков. Обычно используют затемнение и высветление. Все зависит от желаемого результата. Например, затемняют корни, тонируя их темным оттенком, а длину окрашивают методом растяжки в более светлый тон. В технике используются любой цвет — блонд, коричневый, рыжий и тд. Если на протяжении долгого времени использовался один краситель, например темный каштан 4.0, и он надоел, стоит попробовать этот метод. В результате сменить однотонность на интересное, сложное окрашивание. Благодаря объединению нескольких тонов, получается объемный, играющий на свету оттенок.

Двойное окрашивание

Позволяет легко менять цвет на основе своего, натурального оттенка. Если ранее волос не касался краситель, двойное окрашивание может стать лучшим вариантом для начала перемен. Для смены тона используют краску. Ее наносят прядками или растушевкой. Модно выбрать натуральный тон, а для любителей ярких перемен — сочные цвета.

Двойное окрашивание волос фото

Брондирование волос: фото до и после. Модное окрашивание более 100 фото

Если хотите идеальные переливы естественных цветов на волосах, визуальный объем и очень модное окрашивание, тогда вам нужно сделать брондирование волос, которое делают практически все голливудские звезды и не только. Голливудское окрашивание волос BROND (brown + blond) — это и есть брондирование.

Что такое брондирование волос и какие есть виды

Брондирование (brond) — это применение специальных технологий мелирования и многоцветного колорирования волос при помощи которых достигается максимально естественный эффект мягкого перелива цветов.

Цвета должны подбираться исходя от вашего природного цвета волос. Шоколадный, коричневый, кофейный, русый и практически вся золотисто-бежевая гамма с легкими элементами блонда, это все характерные оттенки окрашивания.

Именно брондирование позволяет получить изысканный, максимально естественный перелив нескольких цветов или оттенков.

Выбор в сторону теплой или холодной палитры натуральных оттенков нужно выбирать, исходя из природного оттенка волос, цвета глаз и тона кожи.

Виды брондирования:

  • Эффект выгоревших волос или прядей — перепад цвета от корней к концам волос может быть, как очень незначительным, так и достаточно контрастным: от темно-русого в корнях до светло-пшеничного на концах или от насыщенного каштанового оттенка до золотисто-медового.
  • Плавное углубление цвета по направлению от концов волос к корням, с эффектом омбре — специальные технологии колорирования позволяют создавать плавный переход цвета от более темных корней к окрашенной в стиле brond остальной массе волос, с максимально натуральным переливом цветов и элегантным «растягиванием тона» по длине.
  • Игра нескольких цветовых оттенков, например, в золотисто-коричневой гамме.
  • Мягкий переход от темного к более светлому цвету — данная технология окрашивания позволяет получить эффект плавного углубления цвета у корней волос с максимально естественной границей цветового перехода.
  • Оттеночное обрамление прядей у лица или контура стрижки — можно эффектно оттенить отдельные боковые пряди и локоны у лица.
  • BROND SUPER NATURE с максимально натуральным эффектом — отсутствие ярко выраженных светлых акцентов и контрастных цветовых перепадов. Создаются максимально естественные цветовые комбинации из нескольких натуральных оттенков.
  • Английский brond с эффектом «плавающих», плавно перетекающих друг в друга оттенков.
  • Эффект «плавающих», плавно переливающихся друг в друга оттенков — чем больше близких по тону оттенков используется при подобном окрашивании, тем «богаче» и эффектнее получается перелив цветов.

Преимущества брондирования волос

  • в бронд можно перейти с любого цвета волос;
  • брондировнаие можно сделать как на короткие, так и на длинные волосы;
  • окрашивание придает визуальный объем (грамотно подобранное сочетание нескольких близких по тону светлых оттенков позволяет создать эффект объемной «копны волос» ).

На первый взгляд, кажется, что окрашивание с стиле бронд совсем несложное, пряди окрашиваются хаотично, нет четких указаний или переходов, но на самом деле это одно из самых сложных вариантов окрашивания. От того, насколько профессионально мастер подберет сочетания оттенков и насколько изящно он выполнит цветовые переливы, зависит то, насколько «дорого» и презентабельно будет выглядеть весь образ в целом.

После окрашивания волосы отрастают естественным образом, а переходы цвета остаются такими же насыщенными и изысканными, поэтому ежемесячная коррекция не понадобится. Брондировнаие можно носить от нескольких месяцев до полугода без коррекции.

Из недостатков можно выделить то, что это все таки окрашивание и оно портит волосы, каким бы щадящим оно не было. Поэтому после брондирования нужно качественно ухаживать за волосами (подобрать подходящий шампунь, маску, кондиционер, несмывающее средство и термозащиту). Ну, и само окрашивание дорогостоящее, особенно в профессионального мастера, многие говорят, что это окрашивание равно тонкой ювелирной работе.

Окрашивание бронд на русых и темных волосах

На русых волосах с теплым оттенком роскошно смотрятся золотисто-бежевые, медовые, карамельные и пшеничные блики. Для русых волос с пепельным отливом рекомендуются блики холодных пепельно-бежевых, светло-ореховых и бежево-льняных оттенков.

Шикарно смотрятся на темных волосах шоколадные, коричневые, медово-каштановые, кофейные, коньячные, карамельно-коричневые и другие натуральные цвета. Можно также сочетать с перламутрово-бежевыми, ореховыми, золотисто-пшеничными и даже жемчужными светлыми оттенками.

Модное окрашивание волос 2020: виды и техника с фото

Каждый новый сезон приносит нам новые тренды в одежде, косметике, маникюре и конечно же в окрашивании волос. Колористы каждый день изобретают что-то новое в мире ярких красок. Появляются новые техники окрашивания, а некоторые, наоборот, устаревают, тем не менее, существуют безошибочные варианты. Мы собрали самые популярные техники окрашивания, которые, вероятно, никогда не выйдут из моды. В 2020 году все также в моде естественность и сложные техники окрашивания волос, такие как:

  • Balayage;
  • АirTouch;
  • Техника шатуш;
  • Брондирование и блондирование;
  • Колорирование;
  • Однотонное окрашивание.

Очень сложно покрасить волосы дома и получить желаемый оттенок. Окрашивание — это не то, чего вы, будучи непрофессионалом или не имеющим никакого опыта в окрашивании волос, можете достичь дома.

Окрашивание волос должен проводить тот мастер, которому вы доверяете на все 100%. Внимательно изучите портфолио колориста и аккаунты в Instagram и Youtube. Для начала запланируйте консультацию, принесите понравившиеся фотографии.

Выбор правильного оттенка зависит от оттенка вашей кожи (теплый или прохладный) и ваших личных предпочтений: некоторые предпочитают теплые тона, другие пытаются добиться благородных холодных оттенков. При правильном выборе оттенка, он должен освежает ваше лицо и делать его моложе.

Светлые блики — это обязательный тренд, подходящий для любых природных волос. Помните, что сплошной цвет волос всегда теряется по сравнению с современными размерными колористическими решениями.

Окрашивание балаяж: идеи 2020

Техника окрашивания балаяж — самое топовое окрашивание во всем мире. В некоторых салонах почти 90% работ по окрашиванию — это разные виды балаяжа! Красота балаяжа в том, что цвет окрашивания очень плавно вписывается в ваш естественный цвет волос.

Окрашивание Balayage — это техника окрашивания волос, при которой осветлитель или цвет наносится маленькими треугольными участками (буквой V) волос вручную, традиционно с помощью кисти, то есть работа полностью зависит от мастерства колориста. В результате получаются очень красивые естественные блики, светлее на концах и мягче к корням волос.

Эта техника впервые появилась в Париже и получила название «Balayage à Coton», поскольку колористы использовали (а некоторые до сих пор используют) хлопковые полоски, чтобы изолировать цветные нити от нетронутых волос.

Balayage — отличная техника контурной коррекции лица. Стилисты используют более светлые цвета, где необходима большая ширина, более темные — для ее уменьшения:

  • Круглые и квадратные лица выигрывают от светлых тонов вокруг линии роста волос.
  • Чтобы смягчить углы, стилисты часто выделяют волосы на линии челюсти и висках.
  • Длинное лицо в форме более глубоких темных корней, более светлые полосы над ушами и на концах.
  • Сердечные лица выглядят более сбалансированными с темными корнями, а блики выделяются под линией челюсти.

Balayage популярен не только потому, что он выглядит мега стильно и восхитительно, но также и из-за его легкого обслуживания. Окрашивание балаяж не нужно обновлять каждые несколько недель, честно говоря,оно выглядит красивее когда немного отрастет. Некоторые носят балаяж от 5 до 10 месяцев.

Модные виды балаяж 2020:
  1. Медовый балаяж — подходит для русых и темных волос.
  2. Карамельный балаяж — подходит для брюнеток и черноволосых красавиц. Карамельные блики, в частности, имеют натуральный цвет.
  3. Клубничный блонд балаяж — тренд 2020 года, эта смесь цветов завораживает своей красотой, подойдет для шатенок и русых.
  4. Шоколадно-пепельный балаяж — сочетание шоколадных и светлых оттенков подчеркивает текстуру вьющихся волос и создает иллюзию света, отражающегося от ваших локонов.

Как вы поняли, балаяж — это не просто тенденция, это очень успешная техника. Лучшие стилисты предсказывают, что он никогда не выйдет из моды.

Модное окрашивание 2020: АirTouch

Окрашивание АirTouch — это интересная техника осветления волос, можно даже сказать щадящая. Окрашивание делают с помощью фена, выдувая часть волос. Все волосы делятся на зоны и из каждой зоны берется тоненькая прядь и выдувается феном, так, чтобы от каждой из прядок осталось примерно 30-50% изначального объема, чтобы убрать все короткие и слабые волосы. Чем тоньше пряди разделения, тем качественней будет осветление. На те волосы, которые остаются в руках наносится краска, при этом нужно отступить от корней 3-5 см, потому что корни остаются темными.

АirTouch добавляет глубину и размерность цвету волос, благодаря чему красота естественного цвета просвечивается. Техника окрашивания АirTouch подходит для светлых, русых и темных волос, разной длины и структуры, даже на вьющихся и кудрявых. Такое окрашивание не требует частой коррекции.

Окрашивание волос техникой Шатуш

Если вам, как правило, нравится цвет ваших волос, но вы хотите добавить ему глубину, размерность и модный вид, вы, вероятно, выберете технику окрашивания шатуш. Шатуш придаст вашим волосам солнечный поцелуй, естественный вид или мягкие цветовые переходы.

Шатуш — это плавный переход от темного оттенка к более светлому на концах, при этом корни во время окрашивания не затрагиваются, а концы традиционно осветляются и при желании тонируются в желаемый оттенок. Во время окрашивания волосы делятся на зоны, а потом из каждой зоны берется тоненькая прядь волос и мастер начинает вычесывать, то есть все маленькие волосы вычесываются и остаются длинные, на них и наносится краска, где-то на середину пряди и тушуется вверх и вниз к кончикам. В этом виде окрашивания очень важно сделать правильно растушевку, чем плавнее переход, тем лучше работа мастера.

Шатуш — самое универсальное окрашивание 2020 года, которое подходит для любой структуры волос (вьющиеся, прямые) и его можно подобрать к любому тону кожи. Кудрявые волосы прекрасно показывают все оттенки, смешанные вместе, в то время как прямые пряди показывают тонкости переливов и выкладываются в красивую картину.

В технике шатуш важна индивидуальность для каждого клиента — цвета смешиваются по индивидуальному заказу, ширина более светлых прядей и их расположение выбираются мастером для придания контуру и правильного обрамления лица. С окрашиванием шатуш можно ходить до 6 месяцев без коррекции, а то и дольше.

Брондирование и блондирование волос

Брондирование и блондирование — это применение специальных технологий мелирования и многоцветного колорирования волос при помощи которых достигается максимально естественный эффект мягкого перелива цветов.

Брондировнаие — еще один популярный вид окрашивания для брюнеток, которые хотят освежить свой естественный цвет волос. Тенденция на каштановые светлые волосы возникла из текущей тенденции смешивать несколько цветов одновременно во время окрашивания. Брондирование отлично смотрится на длинных и коротких прядях, одинаково прекрасно подходит для женщин с темными и светло-коричневыми базовыми цветами волос.

Если у вас темные волосы, рассмотрите коричневые, карамельные, шоколадные и коричные блики. Для более смелого эффекта попробуйте красочные полосы. Многое зависит от тона вашей кожи и цвета глаз. Хороший колорист примет во внимание все эти факторы.

Если ваш базовый цвет волос светлый, лучшим вариантом для вас будут светлые оттенки блондирования.

Блондирование волос предусматривает собой мягкое сочетание коричневого и белого цвета волос, в результате вы получаете очень красивые натуральные переходы, мягкие теплые оттенки и очень глубокие цвета волос. Например, сочетание пепельного и карамельного блонда или медового и молочного.

Колорирование волос: модный тренд 2020

Колорирование — самый востребованный вид окрашивания среди голливудских знаменитостей, это безусловный тренд 2020 года. Это окрашивание волос сразу несколькими оттенками приближенными к натуральным. Колорирование придает нереальное свечение волосам, с его помощью можно визуально скрыть недостатки и подчеркнуть достоинства внешности, скорректировать овал лица. Колорирование одно из самых сложных видов окрашивания и конечный результат зависит от профессионализма мастера.

Применение разных цветов отлично подходит для добавления слоев к цвету волос и может помочь создать иллюзию объема для тонких волос.

Окрашивание волос в технике сомбре

Окрашивание Сомбре — это более мягкая версия омбре, которая пришла ему на смену в 2020 году. Контраст между корнями и цветом кончиков волос составляет лишь оттенок или два, поэтому цвет выглядит более плавно и естественно. Этот стиль очень прост в уходе и не требует частого посещения мастера.

Рациональный выбор цвета волос в значительной степени зависит от естественного цвета ваших волос и частично от их длины, но не ограничивается ими. Сомбре идеально позволяет продемонстрировать мягкий переход от темного оттенка к более светлому. Такая техника выглядит более натурально, чем омбре.

Модное окрашивание блонд 2020

Быть блондинкой тяжело и это факт, который даже нет смысла оспаривать, но если у вас есть проверенный мастер, которому вы можете доверить свои волосы, то быть блондинкой не так и сложно. Во-первых, во время окрашивания, мастер использует еще специальные препараты для защиты и реконструкции волос, во-вторых, вы должны периодично приходить к мастеру на восстанавливающие салонные процедуры, которые он вам подберет, исходя из состояния ваших волос. И в третьих, мастер подберет вам специальный домашний уход и даст ценные наставления.

В широкой палитре блонда можно найти оттенок, подходящий практически каждому, в сезоне 2020 большой выбор светлых оттенков:

  1. Платиновый блонд — очень светлые волосы, практически лишенные цвета, являются интересным выбором цвета волос для женщин с прохладными оттенками кожи. Платиновые светлые волосы (ванильное мороженое) произвели настоящий всплеск в этом сезоне!
  2. Медовый блонд — золотистый оттенок, который выглядит натуральнее всего из палитры блонда. Это универсальный оттенок, который подходит абсолютно всем (смуглой и светлой коже, голубым, зеленым и карим глазам).
  3. Карамельный блонд — один из самых востребованных оттенок блонда в 2020 году, он позволяет волосам выглядеть натурально и привлекательно.
  4. Золотистый блон — один из самых популярных оттенков, который не теряет своей актуальности уже много лет, поскольку он выглядит очень стильно и роскошно.
  5. Молочный блонд — подойдет для обладательниц светлой кожи, он отлично подходит для однотонного окрашивания.
  6. Розовый клубничный блонд — отлично подойдет для девушек с карими глазами и смуглой кожей. Розовый блонд хорошо сочетается с балаяжем, сомбре или колорированием.

Вы должны обновлять окрашивание на регулярной основе, чтобы оставаться привлекательной и женственной.

Модное окрашивание волос для брюнеток: фото 2020

Брюнетки достаточно яркие от природы, поэтому они могут наслаждаться разнообразием коротких, средних и длинных волос в их естественном цвете. В то же время экспериментировать с оттенками каштановых волос — большая радость. Шоколадно-каштановые волосы — абсолютный хит последних сезонов и 2020 год не исключение.

Стильные шоколадные оттенки остаются в тренде от сезона к сезону. Палитра шоколадных оттенков варьируется от молочного шоколада с теплыми красными нотами до прохладных горько-сладких. Обычно мы приписываем шоколаду все сладкие и вкусные коричневые цвета, такие как мокко, горячее какао, коричневый трюфель, шоколадная вишня, коричневый сахар, эспрессо, сладкая кола.

Модное окрашивание волос: фото новинки 2020

Более светлые и темные, холодные и теплые оттенки смешиваются настолько искусно, что мы можем наслаждаться целым рядом новых цветов волос, из которых вы можете выбрать нереально красивые и модные оттенки. Фото галерея ниже поможет вам понять, в каком направлении вы хотите двигаться — темнее или светлее, теплее или прохладнее, мягче или ярче. Предлагаем вам лучшие фото новинки модного окрашивания волос 2020:

Окрашивание волос на каре: модные тренды 2020-2021

Так как стрижка каре, каждый год возглавляет стрижки на короткие волосы, являясь самой популярной прической во всем мире, следует обсудить актуальные варианты окрашивания 2020-2021 года.

Каждый новый сезон приносит новые тенденции и техники окрашивания волос, ведь именно окрашиванием мы можем подчеркнуть индивидуальность и оригинальности прически каре. Все виды и техники окрашивания стрижки каре объединяет блеск волос и ухоженность, роскошные волосы прежде всего, независимо какой оттенок вы выбрали.

Особенности окрашивания каре:

  1. Окрашивание — это сложный процесс, который требует профессионализма мастера, его чувства стиля и колористики. Если хотите получить желаемый результат обязательно обращайтесь в салон.
  2. Каждая техника окрашивания волос имеет свои тонкости, которые необходимо учитывать.
  3. Необходимо выбирать такие тона, которые подходят глазам и коже, потому что в противном случае все недостатки внешнего вида будут подчеркнуты и наоборот, с хорошим оттенком вы буквально расцветете.
  4. В отличие от обычной однотонной окраски, использование разных тонов дает замечательный эффект на стрижки каре, волосы выглядят очень живыми и объемными.
  5. С помощью «правильной» стрижки каре и окрашивания можно скорректировать форму лица и подчеркнуть достоинства.
  6. Любое окрашивание травмирует волосы, тем более если для достижения результата необходимо предварительно осветлять волосы. Поэтому позаботьтесь о качественном уходе.

Мы предлагаем фотоподборку актуального и трендового окрашивания на разные виды каре:

  • классическое каре;
  • асимметрическое каре;
  • удлиненное каре;
  • боб-каре;
  • градуированное каре;
  • каре с челкой.

Окрашивание балаяж на стрижку каре: модные тренды 2020-2021

Цель окрашивания балаяж создать светлые блики (из нескольких оттенков) на волосах, которые смотрятся естественно и гармонируют с вашим цветом прядей. Стрижка каре позволяет сделать мягкие вертикальные переходы в окрашивании балаяж. Светлые концы в сочетании с темными корнями роскошно смотрятся во всех оттенках: карамельные, жемчужные, золотистые, медовые, блондинистые.

Окрашивание балаяж идеально подойдет для круглого лица, так как вертикальные линии визуально вытянут лицо. Более детально о технике окрашивания балаяж читайте в этой статье: https://volosomanjaki.com/strizhka-i-ukladka-volos/okrashivanie-balayazh-foto-i-varianty-dlya-raznyx-tipov-volos/

Стрижка каре заиграет плавными переходами и природным объемом с окрашиванием балаяж.

Плюсы:

  • не требует частого окрашивания
  • придает красивые блики и блеск волос
  • придает визуальный объем волосам

Минусы:

  • цена окрашивания
  • для такого окрашивания нужен опытный мастер

Окрашивание сомбре на стрижку каре: фото 2020-2021

Сочетание короткой стрижки с модной техникой сомбре очень эффектно. Вы можете увидеть темные корни, светлые кончики на коротких волосах буквально везде, это сочетается с любым стилем и образом жизни.

Окрашивание сомбре выглядит хорошо и на светлых и на темных волосах. Сомбре более естественное окрашивание, чем омбре, оно предполагает осветленные концы и темные корни с более плавным переходом.

Контраст светлых концов с темными корнями выглядит очень эффектно в 2020-2021 году.

Окрашивание Airtouch на каре: тренд 2020-2021

Если вы хотите плавно превращаться в блондинку, тогда попробуйте технику окрашивания Airtouch. При окрашивании обрабатываются только самые длинные пряди, из которых выдувают пушковые волосы и более слабые и тонкие (волосы обрабатывают безопасным холодным воздухом из фена). На те волосы, которые остаются в руках наносится краска, при этом нужно отступить от корней 3-5 см, потому что корни остаются темными, их можно потом тонировать.

Это окрашивание выглядит очень красиво и естественно, особенно на стрижке каре. AirTouch — вертикальная растяжка цвета, которая придает объем тонким волосам, делает стрижку более выигрышной и текстурированной.

Окрашивание AirTouch дает очень мягкие переходы, грани почти невидно, это идеальное окрашивание для каре в сезоне 2020-2021.

Плюсы:

  • щадящее осветление, окрашиванию поддаются 30-50% волос
  • не требует частой коррекции, так как очень плавно отрастает (5-8 месяцев)

Минусы:

  • цена окрашивания

Окрашивание шатуш на каре

Если у вас короткая стрижка, это не повод отказываться от изменений. Преобразитесь, сделав себе темные корни и яркие светлые кончики на коротких волосах. Эффект плавного перехода цвета буквально изменил современную моду. Техника окрашивания шатуш делает волосы объемными и при этом естественными на вид.

Если вы хотите слегка добавить цвет в ваши волосы, то техника шатуш будет как раз кстати на стрижку каре. Выбор подобного оттенка для волос освежит ваши волосы, но сохранит их естественность. Интересные идеи окрашивания шатуш сезона 2020-2021, смотрите в нашей фотоподборке.

Плюсы:

  • эта техника не окрашивает все волосы
  • окрашивание долго носится от 5 до 10 месяцев

Минусы:

  • цена окрашивания
  • сложность окрашивания

Колорирование волос на стрижку каре: фото 2020-2021

Колорирование волос можно проводить и на светлые и на темные волосы, оно выглядит шикарно на стрижке каре. Это довольно сложна техника окрашивания волос, которая предполагает использование нескольких оттенков одновременно (от 2 до 10), при этом они должны быть близкими по цветовой гамме.

Колорирование делает цвет волос более глубоким, с едва уловимыми переливами, это то что нужно для стрижки каре. Нет какого-то одного модного цвета сезона, в каждом индивидуальном случаи мастер подбирает нужные оттенки, в соответствии с законами колористики.

Плюсы:

  • помогает закрасить седину
  • придает стрижке объем
  • в этой технике можно окрашивать даже самые короткие волосы

Минусы:

  • стоимость окрашивания
  • это сложное окрашивание, которое зависит от умелых рук мастера

Фото вариантов окрашивания Боб каре

Фото окрашивания 2020-2021: удлиненное каре

Длинное каре: варианты окрашивания 2020-2021

Классическое каре

Однотонное темное каре

Даже однотонное окрашивание может освежить стрижку каре в 2020-2021 году. В выборе оттенка стоит опираться на цветотип, то есть принимать во внимание оттенок глаз, кожи и естественный цвет волос. В этом всем вам поможет ваш мастер, он подберет тот оттенок, который подходит именно вам. С однотонным окрашиванием вы сможете:

  • немного изменить имидж, придать цвету волос насыщенность;
  • подчеркнуть стрижку, сделать ее более структурированной;
  • оживить тусклый природный цвет волос, добавить блеску.

Помните, что после окрашивания волосы нуждаются в особом уходе, о котором вы можете почитать здесь.

Окрашивание каре в блонд

Многие девушки любят каре именно в блонде, и это несомненный тренд 2020-2021 года в окрашивании.

Для окрашивания подходят такие оттенки как медовые, карамельные, песочные, пепельные и золотистые тона. Интересные идеи смотрите на фото:

Окрашивание каре в розовый тон

Легкий тон розового хорошо сочетается с каре, эта стрижкой позволяет раскрыть цвет во всей его красе. Розовый цвет может быть разных оттенков:

  1. Теплый (золотистый, персиковый блонд с розовым оттенком)
  2. Холодный (пастельно-розовые, жемчужные, перламутровые тона, розовое золото)

На темных волосах, без предварительного осветления не удастся добиться розового оттенка.

Розовый тон сочетается со всеми техниками окрашивания волос (сомбре, аиртач, балаяж, шатуш).

Фото окрашивания стрижки каре 2020-2021

Предлагаем вам подборку фото-новинок красивых вариантов окрашивания стрижки каре, сезона 2020-2021:

Модное скрытое окрашивание волос

Окрашивание нижних волос в яркий цвет – это одна из самых модных тенденций в окрашивании волос 2020. Скрытое окрашивание достаточно универсально и отлично смотрится, как на…

Скрытое окрашивание волос

Скрытое цветное окрашивание волос

Бывают ситуации, когда хочется смелых экспериментов, но из-за дресс-кода вы не можете себе этого позволить или боитесь, что радикальные перемены в образе окажутся слишком дерзкими.

Для таких случаев есть интересная техника окрашивания волос, которая все еще не снижает свои позиции и является одной из последних трендов – скрытое окрашивание или окрашивание нижнего слоя волос.

Давайте разбираться что это за техника, кому подходит и как ее реализовать в жизнь.

Что такое скрытое окрашивание

Эта техника представляет собой окрашивание локонов в один или несколько контрастных цветов, находящихся под основной массой волос натурального оттенка. Скрытое окрашивание прядей выполняется на нижних или средних слоях волос сзади. Может распределятся, как по всей длине волос, так и только в прикорневой зоне.

Скрытое окрашивание достаточно универсально и отлично смотрится, как на коротких, так и на длинных волосах.

Основной оттенок волос также может быть абсолютно любым, но проще всего воплотить в жизнь такое окрашивание на светлых волосах. Темные же придется предварительно осветлить.

Как правило, при окрашивании нижней части волос в яркий цвет используют цвета: розовый, синий, фиолетовый, зеленый и другие сочные оттенки.

Такие волосы, покрашенные в радугу, становятся особенно заметны при движении, в прическе или укладке.

Виды скрытого окрашивания

Лучше всего скрытое окрашивание делать яркими, броскими оттенками! Иначе абсолютно пропадает весь смысл такого метода. Гамма оттенков очень широка и выбрать бывает сложно, поэтому колористы BeSweet советуют при выборе оттенков опираться на свой цветотип внешности.

Скрытое радужное окрашивание волос

Это самое популярное окрашивание скрытым методом. Здесь ваша фантазия может ни в чем себе не отказывать))

Волосы на затылке, под частью волос натурального оттенка, делятся на пряди и окрашиваются в разные цвета. Можно выкрасить локоны, как в 2-3 контрастных оттенка, так и намного больше использовать цветов. Ведь чем больше будет различных оттенков у вас под натуральными волосами, тем больший фурор вы произведете. Все зависит от профессионализма мастера.

Скрытое окрашивание розовым цветом

В таком варианте используется однотонное цветное окрашивание прядей в розовый цвет, который должен сочетаться с вашим натуральным оттенком волос.

Если у вас волосы светлого оттенка, то вам подойдут, как яркие оттенки, например, фуксия, так и нежно розовые пастельные цвета. А вот, если у вас темные волосы, то лучше отдать оттенкам темно розового цвета.

Скрытое фиолетовое окрашивание

Этот оттенок не менее популярен, чем розовый. Он отлично сочетается, как со светлыми, так и темными волосами, нужно только подобрать свой оттенок лилового.


Для блондинок хорошо подойдут пастельные оттенки фиолетового – цвет сирени и лаванды, а для брюнеток лучше выбирать яркие неоновые фиолетовые оттенки, иначе цветное окрашивание под волосами будет не заметно.

Также можно попробовать модное окрашивание, которое представляет собой плавный переход от ванильного оттенка к нежному лиловому.


Скрытое зеленое окрашивание

Очень яркий вариант, в котором можно подобрать разные оттенки зеленого цвета. Кто-то захочет нежный мятный оттенок, а кто-то кислотный неон. Который отлично сочетается с другими такими же яркими оттенками: розовый, оранжевый, красный.

Скрытое белое окрашивание

Окрашивание прядей волос в холодный блонд хорошо подходит обладательницам темного цвета волос или рыжим фуриям. Таким методом можно добиться очень красивый контраст между оттенками.

Поэтому если у вас от природы темный натуральный цвет волос, попробуйте спрятать под волосами несколько светлых прядей. Когда волосы будут развиваться на ветру и будут периодически видны скрытые локоны, вы будете не подражаемы.

Скрытое окрашивание волос красным

Вишневый, алый, винный оттенки особенно хорошо будут смотреться на брюнетках.

На девушках с рыжими волосами он точно потеряется, поэтому не стоит его применять.

Блондинкам такой оттенок тоже может подойти, но только с условием достаточной густоты волос. Иначе яркое красное скрытое окрашивание будет просвечивать и уже не будет того эффекта «вау».

Скрытое окрашивание синим цветом

Синий оттенок – это самый модный цвет 2020 года в одежде и не только!Он может быть, как нежно-пастельным, так и кричаще – ярким. Первый вариант хорошо подойдет блондинкам (особенно пепельным) и русым девушкам, а второй – брюнеткам.

Окрашивание нижней части волос

Очень важно выбирая оттенки для скрытого окрашивания учесть свой натуральный цвет волос! Давайте по примерам на картинках разбираться более подробно.

Скрытое окрашивание на темные волосы

Перед тем, как сделать скрытое окрашивание на длинных темных волосах или волосах средней длины, им необходимо сделать осветление, иначе яркие пряди не получатся.

Темноволосым девушкам отлично подойдут яркие неоновые оттенки: фуксия, бордо, синий, зеленый и фиолетовый.

Скрытое окрашивание на русые волосы

Натуральные русые волосы могут быть как светлыми, так и более темными. В зависимости от этой интенсивности, мастер будет принимать решение в необходимости предварительного осветления прядей.

В сочетании с русыми волосами будет отлично смотреться скрытое радужное окрашивание. Хотя такому натуральному цвету волос подойдет практически любой оттенок, кроме пастельного, который будет выглядеть блекло.

Скрытое окрашивание на рыжие волосы

Рыжеволосым красавицам для окрашивания нижнего слоя волос особенно хорошо подойдут: блонд и зеленый.

Главное избегать оттенки, которые будут сливаться с ярким природным оттенком, например, красная гамма. Причем если у вас натуральный цвет волос, то осветление прядей вряд ли понадобится.

Скрытое окрашивание на светлые волосы

Для такого окрашивания блондинкам повезло больше всего, потому что им подойдет практически любая цветовая гамма!

Особенно ярко будут смотреться: розовый, сиреневый, голубой, а также радужное окрашивание.По насыщенности подойдет, как пастель, так и неон.

Самое главное, чтобы было достаточно объема волос, чтобы скрыть эту красоту под ними.

На волосах, на которых выполнена модная техника шатуш лучше такой эффект не делать, так как при окрашивании ярких локонов, интенсивность цвета будет разная из-за обесцвеченных прядок.

Достоинства и недостатки метода

Плюсы

    1. Пожалуй, самым главным преимуществом скрытого окрашивания является –

оригинальность!

    И действительно, редко встретишь девушку с таким эффектом на волосах. Оно смотрится очень красиво, особенно на разлетающихся на ветру локонах.

Минусы

    1. Самый большой ее минус, то что это достаточно

новый метод окрашивания в России

    и действительно хорошего мастера найти сложно. К тому же, по аналогичным причинам, это дорогой метод.

Как в домашних условиях сделать скрытое окрашивание

Хотя такой образ сделать самой качественно достаточно сложно, ведь специфика техники заключается в тонировании задней части головы, вполне можно сделать скрытое окрашивание одним цветом.

Колористы BeSweet предлагают простую схему скрытого окрашивания волос.

    Делим весь объем волос на две части по горизонтали от уха до уха и закрепляем заколками. Обратите внимание, что окрашиваемый объем вы контролируете сами! Чем выше пробор, тем большее количество волос будет окрашено.

Как окрасить волосы в два цвета?

Как можно просто изменить себя? Достаточно окрашивания волос и женщина снова становится особенной. Что же делать, если классические варианты уже приелись и хочется чего-то новенького. Тут можно включать фантазию и воображение, как вариант сделать окрашивание волос в два цвета.

Такой способ нынче снова на пике моды. В зависимости от способа окрашивания локонов, двутональный метод имеет ряд названий. Среди них знакомые нам омбре, деграде и балаяж. В жизни просто называем – двойное окрашивание волос, дабы не запутаться, а варианты уже уточняем.

Что такое двойное окрашивание?

Этот способ, профессионалы называют – балаяж. Он основан на сочетании в себе двух цветов, благодаря которым прическа становится яркой, насыщенной и оригинальной. Кто не знает, как выглядит балаяж, можно посмотреть на фото.

Существует несколько вариантов балаяжа:

  1. Окрашивается только макушка головы. Выбирается контрастный цвет, который должен обязательно сильно отличаться от вашего натурального оттенка;
  2. Возможно, также окрашивание нескольких прядей;
  3. Окраска только концов, отдельных локонов. Для этого способа используются осветляющие краски. За счет чего возникает эффект выгоревших волос;
  4. Многоцветное мелирование.

Двойное окрашивание можно рассматривать и по-иному. С другой стороны оно представляет собой осветление волос по сравнению с основным цветом. Чаще всего шевелюре невозможно с первого раза придать желаемый цвет.

На черных и темных локонах требуется процесс поэтапного осветления, чтобы получить желаемый оттенок в конечном результате. Но такое этапное воздействие на шевелюру негативно отражается на её состоянии. Поэтому если локоны уже пересушенные и поврежденные частыми окрасками – лучше от такого способа вообще отказаться.

Окрашивание волос в два цвета — виды

Мелирование

Пожалуй, самый известный способ перевоплощения. Техника простая, заключается в осветлении отдельных прядей на один или несколько тонов светлее, по отношению к вашему родному оттенку. К сожалению, этот способ нельзя назвать щадящим. Главное – не передержать осветлитель, так как итог может быть печальным.

Следует отметить, что мелирование уже в течение месяца теряет первоначальный вид и потребуется коррекция. В целом такой вариант окраски очень освежает и преображает прическу. Идет как ровным волосам, так и кудрявым. Можно попробовать в домашних условиях сделать мелирование, но все – таки лучше обратиться к мастеру. Он выполнит эту процедуру профессионально, что наилучшим образом отразиться на конечном результате причёски.

Амбре

Следующий не менее модный вариант окрашивания волос в два цвета. В результате получаем эффект выгоревших локонов за счет плавного перехода от основного цвета окрашиваемому тону. Если переход не контрастный, то смотрится очень естественно.
Преимуществом амбре является то, что волосы не нужно подкрашивать. А если надоест – просто состричь кончики. Но есть и минусы. Кончики волос всегда суше, чем волосы у корней, поэтому придется использовать средства для увлажнения кончиков волос.

Поперечное колорирование

Принцип процедуры заключается в том, что волосы окрашиваются не вдоль а поперек. Эффектно смотрится и окрашивание в двух близких друг к другу тонах, но контрастные цвета также никто не отменял!

Такое колорирование также можно сделать в домашних условиях, последовательность такая же. Как простой вариант:

  • собрать верхние локоны в пучок;
  • нижние пряди окрасить одним цветом;
  • затем обработать верхние.

Окрашивание волос в два цвета данным способом придаст причёске объём, что можно увидеть на фото.

Частичное колорирование

Здесь главное просто включать фантазию. Можно окрасить любую часть головы, которую вы только захотите. Как пример: выделите несколько прядей, которые будут делать акцент на косой челке, ассиметрии – это будет смотреться довольно элегантно.

Кстати, именно в ассиметричных стрижках актуально и очень красиво смотрится “частичное” колорирование. Возможно даже нанесение смыслового рисунка, но это может сделать только настоящий профи колорирования. Но результаты, конечно, будут непревзойденными.

Окрашивание локонов в два цвета – отличная возможность преображать себя снова и снова, используя различные способы. Ощутите себя неповторимой!

Техники окрашивания

Как рассматривали выше – многие техники окраски можно выполнить в простых домашних условиях. Для этого подбирается качественная красящая смесь необходимого оттенка. Желательно чтобы волосы были средней длины, так как с длинными локонами справиться самостоятельно будет сложно. Обладательницам таких шевелюр лучше сразу обращаться в салоны или парикмахерские во избежание недоразумения.

Как окрасить волосы?

Выделяем нужные пряди, завязываем их резинками. Наносим краску на кончики этих прядей. Не забываем, чем дольше держим краску, тем светлее эффект. Главное не передержать, так как можно повредить волосы. Такие волосы будут сухими и ломкими.

Для многоцветного мелирования потребуется:

  • специальная шапочка;
  • фольга;
  • расческа с тонким концом;
  • осветитель.

Шапочку надеваем на голову, через отверстия высовываем локоны. Наносим оттенок на прядь и заворачиваем в фольгу. Это делается для того, чтобы избежать смешивания цветов при окраске. Оригинально будет смотреться, если выделить боковые пряди. Их еще называют «перья». Пряди нужно отделить от волос и окрасить с помощью кисточки. Затем так же завернуть прядь в фольгу во избежание окраса основного тона.

Для женщин, которые хотят выделиться среди толпы своей яркостью подойдет вариант одновременного окрашивания прядей и челки. Как этот вариант смотрится можно увидеть на фото. Но здесь нужно быть осторожным, обладательницам длинных волос, так как такой вариант окраски для них не подходит.

При любом варианте окрашивания, волосам потребуется дополнительный уход в виде масок и специальных средств, которые помогут восстановить здоровье локонов после химического воздействия краски. Так же никто не отменял народные средства для полоскания и укрепления волос.

 

Иммуногистохимия с двойным окрашиванием

N Am J Med Sci. 2010 May; 2 (5): 241–245.

Сяо Чен

Кафедра патологии и молекулярной медицины, Университет Макмастера, Гамильтон, Онтарио, Канада.

Дан-Би Чо

Кафедра патологии и молекулярной медицины, Университет Макмастера, Гамильтон, Онтарио, Канада.

Ping-Chang Yang

Кафедра патологии и молекулярной медицины, Университет Макмастера, Гамильтон, Онтарио, Канада.

Кафедра патологии и молекулярной медицины, Университет Макмастера, Гамильтон, Онтарио, Канада.

Для корреспонденции: Д-р Пинг-Чанг Ян, комната T3303, 50 Charlton Ave East, Hamilton, ON, Canada L8N 4A6. Тел .: (905) 522-1155 доб. 32934. Факс: (905) 540-6593. [email protected] Авторские права: © Североамериканский журнал медицинских наук

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0 Unported, что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе. при условии правильного цитирования оригинала.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

В этой статье обобщены методы иммуногистохимии, обычно используемые в исследовательских лабораториях и клиниках, включая прямое иммунное окрашивание, непрямое иммунное окрашивание, ферментный метод, метод флуоресценции, метод APC и метод PAP.

Ключевые слова: Иммуногистохимия

Введение

Иммуногистохимия (ИГХ) — полезный инструмент исследования, который используется для локализации специфических антигенов в срезах ткани с помощью меченых антител на основе взаимодействий антиген-антитело.Иммунореактивные продукты можно визуализировать с помощью маркера, включая флуоресцентный краситель, фермент в целом; радиоактивный элемент или коллоидное золото также могут быть использованы.

ИГХ используется не только в исследовательских лабораториях, но и в клинической диагностике; это был один из рутинных диагностических подходов в повседневной клинической деятельности. До поколения IHC гистохимия часто использовалась в клинической диагностике и лабораторных исследованиях. Однако гистохимия была постепенно заменена ИГХ на основе ее очевидного преимущества — специфической реакции антиген-антитело.Теоретически ИГХ может идентифицировать любой существующий белковый антиген в ткани и, таким образом, сделать его критически важным методом в лабораторных исследованиях и методе клинической диагностики.

В этой статье мы стремились обобщить несколько полезных методов IHC, которые использовались в наших лабораториях в течение многих лет. В этой статье подробно описаны отбор тканей, подготовка, прямое окрашивание, непрямое окрашивание, двойное окрашивание и т. Д.

Препарат ткани

Фиксация

Принцип ИГХ фиксации ткани состоит в том, чтобы сохранить минимальную структуру ткани и сохранить большую часть антигенности.Мы должны обеспечить сохранение читаемой архитектуры ткани и морфологии клеток; в противном случае невозможно распознать локализацию иммунореактивных продуктов. Однако, если ткань чрезмерно зафиксирована, антигенность будет уменьшена или даже полностью погашена, что приведет к ложноотрицательному окрашиванию.

Существует широкий спектр фиксирующих методов, из которых можно выбрать. Исследователи выбирают подходящие фиксаторы в зависимости от типов тканей и требований экспериментов. Однако надо сказать, что не существует универсального фиксатора, который бы идеально подходил для окрашивания на все антигены.В общем, большинство антигенов можно успешно продемонстрировать в ткани или срезах, фиксированных ацетоном. Но срезы тканей, фиксированные формалином, также широко используются в IHC, поскольку фиксированные формалином и залитые парафином ткани могут храниться в течение многих лет. Очень удобно использовать залитые в парафин заархивированные ткани для проведения ИГХ. В последние годы использование методов поиска антигена стимулировало применение фиксированных формалином тканей для использования при ИГХ.

Стандартные фиксаторы, используемые для IHC
  • (1)

    100% ацетон.Предварительно охладить в холодильнике. Готовят криосрезы, сушат при комнатной температуре в течение ночи. Фиксировать холодным ацетоном 20 мин.

  • (2)

    4% параформальдегид в 0,1 М фосфатном буфере. Ткань можно разрезать на размер 3 × 3 × 6 мм; фиксируется на 12 ч при комнатной температуре. Сухие криосрезы можно закрепить при комнатной температуре в течение 1 ч.

  • (3)

    2% параформальдегид с 0,2% пикриновой кислотой в 0,1 М фосфатном буфере. Фиксация такая же, как (2).

  • (4)

    Фиксатор PLP: 4% параформальдегид, 0.2% периодата и 1,2% лизина в 0,1 М фосфатном буфере. Фиксация такая же, как (2).

  • (5)

    4% параформальдегид с 0,05% глутаральдегидом (иммуногистохимия ТЕМ). Ткань разрезают на 2 × 2 × 4 мм, фиксируют в течение 2 ч при 4 ° C.

Секции

Криосрезы

Криосрезы — это первый выбор IHC. Это лучший подход с точки зрения сохранения антигенности целевых антигенов. Недостатком криосрезов является плохая морфология, плохое разрешение изображения с большим увеличением.Однако в целом изображение, полученное из криосрезов, может отражать структуру ткани с необходимой значимостью и может удовлетворить требования издателя.

Изготовление замороженных блоков — это первый шаг в криосрезе (). Приготовьте несколько форм-блоков в виде цилиндров диаметром около 1,5 см, сделанных из фольги, заполненной Tissue Tek O.C.T. примерно 1-1,5 см в глубину. Образец ткани следует обрезать до нужного размера и поместить в нижнюю часть цилиндра ОКТ в правильной ориентации.Затем цилиндр ОКТ погружают в жидкий азот примерно на 2-3 мин, пока жидкий азот не перестанет кипеть. Теперь блоки можно хранить при -80 ° C для использования в будущем или перемещать в криостат для разрезания секций.

Изготовление блоков OCT. A-C, изготовление формы из фольги. D, заполните форму OCT. E, вставьте ткань в нижнюю часть формы. F, блок ОКТ после замораживания в жидком азоте.

Образцы мышц или слизистой оболочки могут быть разрезаны на 4-6 микрометров; ткань головного и спинного мозга необходимо разрезать на 10-40 мкм.Кристаллические срезы можно снимать на предметные стекла непосредственно из криостата; промаркированы должным образом, и дайте высохнуть при комнатной температуре в течение ночи или, если срочно, секции можно высушить с помощью мощного вентилятора в течение одного часа.

После высыхания срезы можно обернуть фольгой и хранить при -80 ° C для использования в будущем, или хранить в коробке с крышкой при 4 ° C временно до одной недели, или перейти к стадии окрашивания.

Парафиновые срезы

Преимущество парафиновых срезов заключается в том, что они могут сохранять хорошую структуру ткани, но теряют антигенность из-за фиксации формалином и высокой температуры (60 ° C) во время заливки.Однако иногда у нас нет выбора; например, доступна только ткань, залитая парафином. Следовательно, при ИГХ приходится иметь дело с тканью, фиксированной формалином.

Резать парафиновые срезы относительно проще, чем криосрезы. Один совет здесь заключается в том, что вам нужно подождать, пока секции достаточно расплывутся в теплой ванне. Используя бумажную салфетку, часто оборачивайте пузырьки воды в теплой ванне, иначе пузырь может застрять между секциями и предметными стеклами, и от него будет трудно избавиться.

Парафиновые секции необходимо депарафинизировать с помощью ксилина и повторно гидрировать до воды.

Подготовка всего крепления

Некоторые ткани (толщиной менее 5 мм), такие как слизистая оболочка, могут быть исследованы IHC как целые крепления. Все препараты могут отображать трехмерную информацию о расположении антигенов, таких как нейроны и нервные волокна. Из-за толщины антителам трудно проникнуть в ткань. Обработка Triton X-100 может увеличить проницаемость и улучшить результаты окрашивания.

Поиск антигена

После фиксации эпитопы в ткани могут быть сшиты и покрыты, что затрудняет связывание антител. Путем предварительной обработки реагентом или процедурами для извлечения антигена можно значительно повторно открыть сшитые эпитопы, так что антитела могут легко связываться с антигенами-мишенями. Было предложено несколько подходов для извлечения антигенов, включая извлечение тепла и извлечение ферментов.

Отвод тепла
  • (1)

    Отвод тепла паром: Поместите секции в контейнер, содержащий цитратный буфер (pH 6.0) и поместите емкость в паровой аппарат. Установите температуру 100 ° C и дайте закипеть 20 мин.

  • (2)

    Для этой цели также можно использовать другие устройства, такие как микроволновая печь, скороварка.

Извлечение ферментов

Протеиназа k, трипсин, химотрипсин, пепсин, проназа и различные другие протеазы могут использоваться для извлечения антигенов из фиксированной формалином ткани. Концентрация и время обработки варьируются в зависимости от времени фиксации и концентраций.Пользователям необходимо проверить состояние в предварительном изучении.

Комбинация извлечения с нагревом и извлечения фермента

Этот подход можно использовать в качестве второго выбора, когда извлечение с нагреванием или извлечение фермента не работают. Опять же, в предварительном исследовании необходимо проверить такие условия, как время обработки и концентрации ферментов.

Метод боргидрида натрия

Обработка борогидридом натрия (1% в фосфатном буфере) может использоваться для извлечения антигена из фиксированной формалином ткани.Он особенно хорош для извлечения антигенов из ткани, фиксированной глутарадегидом. Время обработки необходимо проверить до эксперимента.

Примечание: Triton X-100 не подходит для извлечения антигенов, если известно, что антигены локализуются на поверхности клеток, потому что Triton X-100 разрушает структуру мембраны.

Методы ИГХ

Блокирование

Некоторые эндогенные вещества могут влиять на результаты ИГХ, например, эндогенная пероксидаза, эндогенная флуоресценция, способность связывания эндогенных антител (рецепторы Fc), эндогенный биотин.Следовательно, блокирование фонового окрашивания имеет решающее значение при ИГХ, чтобы избежать ложноположительного окрашивания.

Блокирование эндогенных ферментов
  • (1)

    Эндогенные ферменты, такие как AlkPhos, AcPhos и эстеразы, могут быть разрушены кипячением, даже кратковременным при 100 ° C.

  • (2)

    Пероксидаза не является заблокирован кипячением. Это можно сделать путем предварительной инкубации слайдов в 3% H 2 O 2 в 1% PBS азида натрия в течение 30 минут плюс несколько промывок.

  • (3)

    Пероксидаза также может блокироваться 1,5% H 2 O 2 в абсолютном метаноле. Инкубация с метанолом также является этапом фиксации, который может повлиять на окрашивание. По опыту автора метод (2) лучше, чем метод (3). показывает изображения ИГХ при окрашивании с блокировкой (А) или без (В).

    Сравнение изображений IHC с блокировкой или без нее. Сегменты кишечника обрабатывались для ИГХ с блокадой или без нее. Два типичных изображения показывают эффект блокировки.На незаблокированном изображении показаны результаты окрашивания, при которых не только очень грязные, но и не окрашивались положительные клетки.

Блокирование эндогенной флуоресценции

Блокирование эндогенной флуоресценции очень сложно. Предварительная обработка ультрафиолетом в течение 20 минут дает определенный эффект.

Блокирование эндогенного биотина

Эндогенный биотин можно заблокировать с помощью имеющихся в продаже наборов. Эффективные реагенты в этих наборах — свободный авидин. Пользователи также могут с помощью этих компонентов блокировать эндогенный биотин.Кроме того, это также можно сделать с помощью следующих процедур:

Примечание: блокировать эндогенный биотин только тогда, когда вы используете систему биотин-авидин в своем эксперименте. В противном случае в этом нет необходимости.

Блокирование эндогенного рецептора Fc

Поскольку рецепторы Fc высоко экспрессируются на макрофагах, В-клетках, Т-клетках и других типах клеток, которые имеют предпочтительную авидность для связывания антител, используемых в ИГХ, блокирование рецептора Fc в ткани является необходимым. Как правило, рецепторы Fc в ткани могут быть заблокированы путем инкубации с 1% сывороткой того же вида в течение 30 мин.

Положительный контроль

Положительный контроль используется только в случае отрицательного результата. Он используется для тестирования протокола, чтобы убедиться, что он работает. Вы должны найти ткань, которая знает положительный интересующий антиген, используя ее в качестве ткани положительного контроля. Если ткань положительного контроля показала отрицательное окрашивание, протокол или процедура должны быть проблемными и должны быть протестированы до тех пор, пока не будет получено хорошее положительное окрашивание.

Отрицательный контроль
  • (1)

    Пропустите первое антитело и добавьте сыворотку от хозяина первого антитела.

  • (2)

    Добавить изотип IgG от хозяина первого антитела.

  • (3)

    Адсорбция первичного антитела антигеном-мишенью перед использованием.

Прямой метод

Прямой метод экономит время, детективный маркер (например, HRP, флуоресценция) метится на первом антителе; но он не так эффективен, как косвенный метод, потому что сигнал не усиливается.

Косвенный метод

Косвенный метод использует немеченое первичное антитело (первое антитело) против антигена-мишени в ткани и меченое вторичное антитело.Второе антитело реагирует с первичным антителом (вторичное антитело обычно вырабатывается у животного путем примирования животного IgG от хозяина первичного антитела). Косвенный метод намного более чувствителен, чем прямой метод, потому что детективный сигнал усиливается за счет связывания более чем одной молекулы второго антитела с молекулой первого антитела.

Второе антитело можно пометить флуоресцентным красителем, таким как FITC, PE и Cy5 (метод непрямой иммунофлуоресценции). Второе антитело также может быть помечено ферментом, таким как пероксидаза, щелочная фосфатаза или глюкозооксидаза (непрямой иммуноферментный метод, см. Изображения).

Результаты непрямого окрашивания. Сегменты кишечника обрабатывали на ИГХ для окрашивания нервной ткани антителами против PGP9.5, меченными FITC или Cy5.

Метод PAP (метод пероксидазы и антипероксидазы;)

Окрашивание PAP показывает Т-клетки и В-клетки в ткани кишечника. Биопсию толстой кишки обрабатывали для локализации В-клеток и Т-клеток в кишечнике методом PAP, как описано выше.

Этот метод является продолжением непрямого иммуноферментного метода. Он добавляет в систему третье антитело, антитело против пероксидазы.Третье антитело связывается с пероксидазой второго антитела с образованием прочного комплекса. Преимущество метода PAP заключается в увеличении разведения первичного антитела, снижении фона. Недостаток — больше внимания уделять эндогенной пероксидазе; иногда возникает вопрос о неспецифическом окрашивании.

Комплексный метод авидин-биотин

Авидин представляет собой основной гликопротеин (молекулярная масса 68 кД), который имеет высокое сродство к малому (молекулярная масса 24 кДа) водорастворимому витамину биотину.Биотин может быть конъюгирован с множеством биологических молекул, включая антитела, и многие молекулы биотина могут быть присоединены к одной молекуле белка. Таким образом, биотинилированный белок может связываться более чем с одной молекулой авидина. Аббревиатура «ABC» образована от этих трех слов: авидин-биотиновый комплекс. Метод ABC на самом деле является стандартным косвенным методом. Мы указываем на это здесь потому, что он дает гораздо лучший эффект по сравнению с другими косвенными методами. При этом детективный сигнал сильно усиливается.Недостатком использования авидина является его неспецифическое связывание с отрицательно заряженными структурами, такими как ядро. Использование стрептавдина может уменьшить неспецифическое связывание.

Double IHC

Double IHC фактически является косвенным методом IHC. Разница в двойном ИГХ, используется два набора антител. Ниже приведен пример протокола для IHC.

Двойная ИГХ с конфокальной микроскопией (протокол, см. Изображение)

Двойное окрашивание колокализует ChAT и 5-HTR2 на нейронах блуждающего нерва.Культивированные нейроны блуждающего нерва окрашивали анти-холинацетилтрансферазой (ChAT) и анти-5-HTR2-антителами с помощью процедур, описанных выше.

  • (1)

    После фиксации ацетоном срезы дважды промывают в TBST.

  • (2)

    Блок с 1-3% BSA или 1-3% козьей сывороткой в ​​течение 30 минут при комнатной температуре.

  • (3)

    Поместите срезы в увлажненный бокс, добавьте первые антитела (антитело A помечено биотином; антитело B не помечено), оставьте на 1 час при комнатной температуре или при 4 ° C в течение ночи.

  • (4)

    Промыть TBST (5 мин, 3 раза, 5 × 3).

  • (5)

    Добавьте флюоресцентный (например, FITC, PE или Cy5) стрептавидин (для антитела A) и второе антитело (меченное флуоресценцией, имеющей длину переплетения, отличную от длины переплетения, меченного стрептавидином) против антитело B. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.

  • (6)

    Промывка (5 × 3).

  • (7)

    Установите покровное стекло со средой, препятствующей выцветанию.

  • (8)

    Наблюдать в конфокальный микроскоп.

Ссылки

1. Милде П., Мерк Дж., Ритц Е., Хаусслер М. Р., Раутерберг Е. В.. Иммуногистохимическое обнаружение рецепторов 1,25-дигидроксивитамина D3 и рецепторов эстрогенов с помощью моноклональных антител: сравнение четырех методов иммунопероксидазы. J Histochem Cytochem. 1989; 37: 1609–1617. [PubMed] 2. Иммуноцитохимические методы и протоколы. 2-е издание. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press; 1999 г. 3. Джорно Р. Сравнение двух методов окрашивания иммунопероксидазой, основанных на взаимодействии авидин-биотин. Diagn Immunol. 1984; 2: 161–166. [PubMed] 4. Pezet S, Spyropoulos A, Williams RJ, McMahon SB. Активно-зависимое фосфорилирование Akt / PKB во взрослых нейронах DRG. Eur J Neurosci. 2005; 21: 1785–1797. [PubMed] 5. Нэгл РБ, Кларк В.А., МакДэниел К.М., Дэвис-младший. Иммуногистохимическая демонстрация кератинов в новообразованиях яичников человека. Сравнение методов.J Histochem Cytochem. 1983; 31: 1010–1014. [PubMed] 6. Ramos-Vara JA. Технические аспекты иммуногистохимии. Vet Pathol. 2005. 42: 405–426. [PubMed] 7. Орос Дж., Мацусита С., Родригес Дж. Л., Родригес Ф., Фернандес А. Демонстрация бациллы CAR крыс с использованием метода меченого стрептавидин-биотина (LSAB). J Vet Med Sci. 1996. 58: 1219–1221. [PubMed] 8. Ши З.Р., Ицковиц Ш., Ким Ю.С. Сравнение трех методов иммунопероксидазы для обнаружения антигена в тканях колоректальной карциномы.J Histochem Cytochem. 1988. 36: 317–322. [PubMed]

Иммуногистохимия с двойным окрашиванием

N Am J Med Sci. 2010 May; 2 (5): 241–245.

Сяо Чен

Кафедра патологии и молекулярной медицины, Университет Макмастера, Гамильтон, Онтарио, Канада.

Дан-Би Чо

Кафедра патологии и молекулярной медицины, Университет Макмастера, Гамильтон, Онтарио, Канада.

Ping-Chang Yang

Кафедра патологии и молекулярной медицины, Университет Макмастера, Гамильтон, Онтарио, Канада.

Кафедра патологии и молекулярной медицины, Университет Макмастера, Гамильтон, Онтарио, Канада.

Для корреспонденции: Д-р Пинг-Чанг Ян, комната T3303, 50 Charlton Ave East, Hamilton, ON, Canada L8N 4A6. Тел .: (905) 522-1155 доб. 32934. Факс: (905) 540-6593. [email protected] Авторские права: © Североамериканский журнал медицинских наук

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0 Unported, что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе. при условии правильного цитирования оригинала.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

В этой статье обобщены методы иммуногистохимии, обычно используемые в исследовательских лабораториях и клиниках, включая прямое иммунное окрашивание, непрямое иммунное окрашивание, ферментный метод, метод флуоресценции, метод APC и метод PAP.

Ключевые слова: Иммуногистохимия

Введение

Иммуногистохимия (ИГХ) — полезный инструмент исследования, который используется для локализации специфических антигенов в срезах ткани с помощью меченых антител на основе взаимодействий антиген-антитело.Иммунореактивные продукты можно визуализировать с помощью маркера, включая флуоресцентный краситель, фермент в целом; радиоактивный элемент или коллоидное золото также могут быть использованы.

ИГХ используется не только в исследовательских лабораториях, но и в клинической диагностике; это был один из рутинных диагностических подходов в повседневной клинической деятельности. До поколения IHC гистохимия часто использовалась в клинической диагностике и лабораторных исследованиях. Однако гистохимия была постепенно заменена ИГХ на основе ее очевидного преимущества — специфической реакции антиген-антитело.Теоретически ИГХ может идентифицировать любой существующий белковый антиген в ткани и, таким образом, сделать его критически важным методом в лабораторных исследованиях и методе клинической диагностики.

В этой статье мы стремились обобщить несколько полезных методов IHC, которые использовались в наших лабораториях в течение многих лет. В этой статье подробно описаны отбор тканей, подготовка, прямое окрашивание, непрямое окрашивание, двойное окрашивание и т. Д.

Препарат ткани

Фиксация

Принцип ИГХ фиксации ткани состоит в том, чтобы сохранить минимальную структуру ткани и сохранить большую часть антигенности.Мы должны обеспечить сохранение читаемой архитектуры ткани и морфологии клеток; в противном случае невозможно распознать локализацию иммунореактивных продуктов. Однако, если ткань чрезмерно зафиксирована, антигенность будет уменьшена или даже полностью погашена, что приведет к ложноотрицательному окрашиванию.

Существует широкий спектр фиксирующих методов, из которых можно выбрать. Исследователи выбирают подходящие фиксаторы в зависимости от типов тканей и требований экспериментов. Однако надо сказать, что не существует универсального фиксатора, который бы идеально подходил для окрашивания на все антигены.В общем, большинство антигенов можно успешно продемонстрировать в ткани или срезах, фиксированных ацетоном. Но срезы тканей, фиксированные формалином, также широко используются в IHC, поскольку фиксированные формалином и залитые парафином ткани могут храниться в течение многих лет. Очень удобно использовать залитые в парафин заархивированные ткани для проведения ИГХ. В последние годы использование методов поиска антигена стимулировало применение фиксированных формалином тканей для использования при ИГХ.

Стандартные фиксаторы, используемые для IHC
  • (1)

    100% ацетон.Предварительно охладить в холодильнике. Готовят криосрезы, сушат при комнатной температуре в течение ночи. Фиксировать холодным ацетоном 20 мин.

  • (2)

    4% параформальдегид в 0,1 М фосфатном буфере. Ткань можно разрезать на размер 3 × 3 × 6 мм; фиксируется на 12 ч при комнатной температуре. Сухие криосрезы можно закрепить при комнатной температуре в течение 1 ч.

  • (3)

    2% параформальдегид с 0,2% пикриновой кислотой в 0,1 М фосфатном буфере. Фиксация такая же, как (2).

  • (4)

    Фиксатор PLP: 4% параформальдегид, 0.2% периодата и 1,2% лизина в 0,1 М фосфатном буфере. Фиксация такая же, как (2).

  • (5)

    4% параформальдегид с 0,05% глутаральдегидом (иммуногистохимия ТЕМ). Ткань разрезают на 2 × 2 × 4 мм, фиксируют в течение 2 ч при 4 ° C.

Секции

Криосрезы

Криосрезы — это первый выбор IHC. Это лучший подход с точки зрения сохранения антигенности целевых антигенов. Недостатком криосрезов является плохая морфология, плохое разрешение изображения с большим увеличением.Однако в целом изображение, полученное из криосрезов, может отражать структуру ткани с необходимой значимостью и может удовлетворить требования издателя.

Изготовление замороженных блоков — это первый шаг в криосрезе (). Приготовьте несколько форм-блоков в виде цилиндров диаметром около 1,5 см, сделанных из фольги, заполненной Tissue Tek O.C.T. примерно 1-1,5 см в глубину. Образец ткани следует обрезать до нужного размера и поместить в нижнюю часть цилиндра ОКТ в правильной ориентации.Затем цилиндр ОКТ погружают в жидкий азот примерно на 2-3 мин, пока жидкий азот не перестанет кипеть. Теперь блоки можно хранить при -80 ° C для использования в будущем или перемещать в криостат для разрезания секций.

Изготовление блоков OCT. A-C, изготовление формы из фольги. D, заполните форму OCT. E, вставьте ткань в нижнюю часть формы. F, блок ОКТ после замораживания в жидком азоте.

Образцы мышц или слизистой оболочки могут быть разрезаны на 4-6 микрометров; ткань головного и спинного мозга необходимо разрезать на 10-40 мкм.Кристаллические срезы можно снимать на предметные стекла непосредственно из криостата; промаркированы должным образом, и дайте высохнуть при комнатной температуре в течение ночи или, если срочно, секции можно высушить с помощью мощного вентилятора в течение одного часа.

После высыхания срезы можно обернуть фольгой и хранить при -80 ° C для использования в будущем, или хранить в коробке с крышкой при 4 ° C временно до одной недели, или перейти к стадии окрашивания.

Парафиновые срезы

Преимущество парафиновых срезов заключается в том, что они могут сохранять хорошую структуру ткани, но теряют антигенность из-за фиксации формалином и высокой температуры (60 ° C) во время заливки.Однако иногда у нас нет выбора; например, доступна только ткань, залитая парафином. Следовательно, при ИГХ приходится иметь дело с тканью, фиксированной формалином.

Резать парафиновые срезы относительно проще, чем криосрезы. Один совет здесь заключается в том, что вам нужно подождать, пока секции достаточно расплывутся в теплой ванне. Используя бумажную салфетку, часто оборачивайте пузырьки воды в теплой ванне, иначе пузырь может застрять между секциями и предметными стеклами, и от него будет трудно избавиться.

Парафиновые секции необходимо депарафинизировать с помощью ксилина и повторно гидрировать до воды.

Подготовка всего крепления

Некоторые ткани (толщиной менее 5 мм), такие как слизистая оболочка, могут быть исследованы IHC как целые крепления. Все препараты могут отображать трехмерную информацию о расположении антигенов, таких как нейроны и нервные волокна. Из-за толщины антителам трудно проникнуть в ткань. Обработка Triton X-100 может увеличить проницаемость и улучшить результаты окрашивания.

Поиск антигена

После фиксации эпитопы в ткани могут быть сшиты и покрыты, что затрудняет связывание антител. Путем предварительной обработки реагентом или процедурами для извлечения антигена можно значительно повторно открыть сшитые эпитопы, так что антитела могут легко связываться с антигенами-мишенями. Было предложено несколько подходов для извлечения антигенов, включая извлечение тепла и извлечение ферментов.

Отвод тепла
  • (1)

    Отвод тепла паром: Поместите секции в контейнер, содержащий цитратный буфер (pH 6.0) и поместите емкость в паровой аппарат. Установите температуру 100 ° C и дайте закипеть 20 мин.

  • (2)

    Для этой цели также можно использовать другие устройства, такие как микроволновая печь, скороварка.

Извлечение ферментов

Протеиназа k, трипсин, химотрипсин, пепсин, проназа и различные другие протеазы могут использоваться для извлечения антигенов из фиксированной формалином ткани. Концентрация и время обработки варьируются в зависимости от времени фиксации и концентраций.Пользователям необходимо проверить состояние в предварительном изучении.

Комбинация извлечения с нагревом и извлечения фермента

Этот подход можно использовать в качестве второго выбора, когда извлечение с нагреванием или извлечение фермента не работают. Опять же, в предварительном исследовании необходимо проверить такие условия, как время обработки и концентрации ферментов.

Метод боргидрида натрия

Обработка борогидридом натрия (1% в фосфатном буфере) может использоваться для извлечения антигена из фиксированной формалином ткани.Он особенно хорош для извлечения антигенов из ткани, фиксированной глутарадегидом. Время обработки необходимо проверить до эксперимента.

Примечание: Triton X-100 не подходит для извлечения антигенов, если известно, что антигены локализуются на поверхности клеток, потому что Triton X-100 разрушает структуру мембраны.

Методы ИГХ

Блокирование

Некоторые эндогенные вещества могут влиять на результаты ИГХ, например, эндогенная пероксидаза, эндогенная флуоресценция, способность связывания эндогенных антител (рецепторы Fc), эндогенный биотин.Следовательно, блокирование фонового окрашивания имеет решающее значение при ИГХ, чтобы избежать ложноположительного окрашивания.

Блокирование эндогенных ферментов
  • (1)

    Эндогенные ферменты, такие как AlkPhos, AcPhos и эстеразы, могут быть разрушены кипячением, даже кратковременным при 100 ° C.

  • (2)

    Пероксидаза не является заблокирован кипячением. Это можно сделать путем предварительной инкубации слайдов в 3% H 2 O 2 в 1% PBS азида натрия в течение 30 минут плюс несколько промывок.

  • (3)

    Пероксидаза также может блокироваться 1,5% H 2 O 2 в абсолютном метаноле. Инкубация с метанолом также является этапом фиксации, который может повлиять на окрашивание. По опыту автора метод (2) лучше, чем метод (3). показывает изображения ИГХ при окрашивании с блокировкой (А) или без (В).

    Сравнение изображений IHC с блокировкой или без нее. Сегменты кишечника обрабатывались для ИГХ с блокадой или без нее. Два типичных изображения показывают эффект блокировки.На незаблокированном изображении показаны результаты окрашивания, при которых не только очень грязные, но и не окрашивались положительные клетки.

Блокирование эндогенной флуоресценции

Блокирование эндогенной флуоресценции очень сложно. Предварительная обработка ультрафиолетом в течение 20 минут дает определенный эффект.

Блокирование эндогенного биотина

Эндогенный биотин можно заблокировать с помощью имеющихся в продаже наборов. Эффективные реагенты в этих наборах — свободный авидин. Пользователи также могут с помощью этих компонентов блокировать эндогенный биотин.Кроме того, это также можно сделать с помощью следующих процедур:

Примечание: блокировать эндогенный биотин только тогда, когда вы используете систему биотин-авидин в своем эксперименте. В противном случае в этом нет необходимости.

Блокирование эндогенного рецептора Fc

Поскольку рецепторы Fc высоко экспрессируются на макрофагах, В-клетках, Т-клетках и других типах клеток, которые имеют предпочтительную авидность для связывания антител, используемых в ИГХ, блокирование рецептора Fc в ткани является необходимым. Как правило, рецепторы Fc в ткани могут быть заблокированы путем инкубации с 1% сывороткой того же вида в течение 30 мин.

Положительный контроль

Положительный контроль используется только в случае отрицательного результата. Он используется для тестирования протокола, чтобы убедиться, что он работает. Вы должны найти ткань, которая знает положительный интересующий антиген, используя ее в качестве ткани положительного контроля. Если ткань положительного контроля показала отрицательное окрашивание, протокол или процедура должны быть проблемными и должны быть протестированы до тех пор, пока не будет получено хорошее положительное окрашивание.

Отрицательный контроль
  • (1)

    Пропустите первое антитело и добавьте сыворотку от хозяина первого антитела.

  • (2)

    Добавить изотип IgG от хозяина первого антитела.

  • (3)

    Адсорбция первичного антитела антигеном-мишенью перед использованием.

Прямой метод

Прямой метод экономит время, детективный маркер (например, HRP, флуоресценция) метится на первом антителе; но он не так эффективен, как косвенный метод, потому что сигнал не усиливается.

Косвенный метод

Косвенный метод использует немеченое первичное антитело (первое антитело) против антигена-мишени в ткани и меченое вторичное антитело.Второе антитело реагирует с первичным антителом (вторичное антитело обычно вырабатывается у животного путем примирования животного IgG от хозяина первичного антитела). Косвенный метод намного более чувствителен, чем прямой метод, потому что детективный сигнал усиливается за счет связывания более чем одной молекулы второго антитела с молекулой первого антитела.

Второе антитело можно пометить флуоресцентным красителем, таким как FITC, PE и Cy5 (метод непрямой иммунофлуоресценции). Второе антитело также может быть помечено ферментом, таким как пероксидаза, щелочная фосфатаза или глюкозооксидаза (непрямой иммуноферментный метод, см. Изображения).

Результаты непрямого окрашивания. Сегменты кишечника обрабатывали на ИГХ для окрашивания нервной ткани антителами против PGP9.5, меченными FITC или Cy5.

Метод PAP (метод пероксидазы и антипероксидазы;)

Окрашивание PAP показывает Т-клетки и В-клетки в ткани кишечника. Биопсию толстой кишки обрабатывали для локализации В-клеток и Т-клеток в кишечнике методом PAP, как описано выше.

Этот метод является продолжением непрямого иммуноферментного метода. Он добавляет в систему третье антитело, антитело против пероксидазы.Третье антитело связывается с пероксидазой второго антитела с образованием прочного комплекса. Преимущество метода PAP заключается в увеличении разведения первичного антитела, снижении фона. Недостаток — больше внимания уделять эндогенной пероксидазе; иногда возникает вопрос о неспецифическом окрашивании.

Комплексный метод авидин-биотин

Авидин представляет собой основной гликопротеин (молекулярная масса 68 кД), который имеет высокое сродство к малому (молекулярная масса 24 кДа) водорастворимому витамину биотину.Биотин может быть конъюгирован с множеством биологических молекул, включая антитела, и многие молекулы биотина могут быть присоединены к одной молекуле белка. Таким образом, биотинилированный белок может связываться более чем с одной молекулой авидина. Аббревиатура «ABC» образована от этих трех слов: авидин-биотиновый комплекс. Метод ABC на самом деле является стандартным косвенным методом. Мы указываем на это здесь потому, что он дает гораздо лучший эффект по сравнению с другими косвенными методами. При этом детективный сигнал сильно усиливается.Недостатком использования авидина является его неспецифическое связывание с отрицательно заряженными структурами, такими как ядро. Использование стрептавдина может уменьшить неспецифическое связывание.

Double IHC

Double IHC фактически является косвенным методом IHC. Разница в двойном ИГХ, используется два набора антител. Ниже приведен пример протокола для IHC.

Двойная ИГХ с конфокальной микроскопией (протокол, см. Изображение)

Двойное окрашивание колокализует ChAT и 5-HTR2 на нейронах блуждающего нерва.Культивированные нейроны блуждающего нерва окрашивали анти-холинацетилтрансферазой (ChAT) и анти-5-HTR2-антителами с помощью процедур, описанных выше.

  • (1)

    После фиксации ацетоном срезы дважды промывают в TBST.

  • (2)

    Блок с 1-3% BSA или 1-3% козьей сывороткой в ​​течение 30 минут при комнатной температуре.

  • (3)

    Поместите срезы в увлажненный бокс, добавьте первые антитела (антитело A помечено биотином; антитело B не помечено), оставьте на 1 час при комнатной температуре или при 4 ° C в течение ночи.

  • (4)

    Промыть TBST (5 мин, 3 раза, 5 × 3).

  • (5)

    Добавьте флюоресцентный (например, FITC, PE или Cy5) стрептавидин (для антитела A) и второе антитело (меченное флуоресценцией, имеющей длину переплетения, отличную от длины переплетения, меченного стрептавидином) против антитело B. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.

  • (6)

    Промывка (5 × 3).

  • (7)

    Установите покровное стекло со средой, препятствующей выцветанию.

  • (8)

    Наблюдать в конфокальный микроскоп.

Ссылки

1. Милде П., Мерк Дж., Ритц Е., Хаусслер М. Р., Раутерберг Е. В.. Иммуногистохимическое обнаружение рецепторов 1,25-дигидроксивитамина D3 и рецепторов эстрогенов с помощью моноклональных антител: сравнение четырех методов иммунопероксидазы. J Histochem Cytochem. 1989; 37: 1609–1617. [PubMed] 2. Иммуноцитохимические методы и протоколы. 2-е издание. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press; 1999 г. 3. Джорно Р. Сравнение двух методов окрашивания иммунопероксидазой, основанных на взаимодействии авидин-биотин. Diagn Immunol. 1984; 2: 161–166. [PubMed] 4. Pezet S, Spyropoulos A, Williams RJ, McMahon SB. Активно-зависимое фосфорилирование Akt / PKB во взрослых нейронах DRG. Eur J Neurosci. 2005; 21: 1785–1797. [PubMed] 5. Нэгл РБ, Кларк В.А., МакДэниел К.М., Дэвис-младший. Иммуногистохимическая демонстрация кератинов в новообразованиях яичников человека. Сравнение методов.J Histochem Cytochem. 1983; 31: 1010–1014. [PubMed] 6. Ramos-Vara JA. Технические аспекты иммуногистохимии. Vet Pathol. 2005. 42: 405–426. [PubMed] 7. Орос Дж., Мацусита С., Родригес Дж. Л., Родригес Ф., Фернандес А. Демонстрация бациллы CAR крыс с использованием метода меченого стрептавидин-биотина (LSAB). J Vet Med Sci. 1996. 58: 1219–1221. [PubMed] 8. Ши З.Р., Ицковиц Ш., Ким Ю.С. Сравнение трех методов иммунопероксидазы для обнаружения антигена в тканях колоректальной карциномы.J Histochem Cytochem. 1988. 36: 317–322. [PubMed]

Методы и визуализации для наблюдения с помощью спектральной визуализации

J Histochem Cytochem. 2008 Apr; 56 (4): 313–328.

Отделение патологии, Академический медицинский центр, Амстердам, Нидерланды

Для корреспонденции: Крис М. ван дер Лоос, доктор философии, отделение патологии, Академический медицинский центр, M2-230 Meibergdreef 9, NL-1105 AZ Амстердам, Нидерланды. Эл. Почта: [email protected]

Поступила в редакцию 19 ноября 2007 г .; Принята в печать 26 ноября 2007 г.

Copyright © 2008, The Histochemical Society, Inc. Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Существует несколько концепций окрашивания и цветовых комбинаций для успешного двойного иммуноферментного окрашивания образцов тканей человека. Большинство этих концепций основано на различиях между обоими первичными антителами: видами животных, изотипом мышиного Ig или подклассами IgG, конъюгатами или концентрациями. Традиционно при двойном иммуноферментном окрашивании использовались хромогены, выбранные для обеспечения максимального цветового контраста при наблюдении невооруженным глазом.К сожалению, визуально хорошие цветовые комбинации всегда включают по крайней мере один диффузный хромоген из-за нехватки подходящих цветов хромогена. Эта ситуация радикально меняется с использованием спектральной визуализации, когда многоцветная микроскопия может быть разделена на отдельные изображения на основе их спектральных характеристик. Спектральное разделение может быть выполнено даже при четырехкратном иммуноферментном окрашивании. Эта работа содержит практические предложения по процедурам двойного иммуноферментного окрашивания для некоторых часто встречающихся комбинаций первичных антител: кролик – мышь, коза – мышь, мышь – мышь и кролик – кролик.Все предлагаемые протоколы подходят для классической красно-коричневой цветовой комбинации плюс синего ядерного контрастного вещества, которое состоит из активности пероксидазы (диаминобензидинтетрагидрохлорид), активности щелочной фосфатазы (жидкий постоянный красный) и гематоксилина, соответственно. Хотя красный и коричневый хромогены не очень хорошо контрастируют визуально, они оба демонстрируют четкую локализацию и могут быть полностью разделены при помощи спектральной визуализации. (J Histochem Cytochem 56: 313–328, 2008)

Ключевые слова: иммуно-двойное окрашивание, иммуно-квадрупольное окрашивание, хромогены, спектральная визуализация, разложение окрашивают с использованием единичных иммуногистохимических методов (ИГХ) для визуализации одного конкретного антигена в ткани по цветному продукту ферментативной реакции.Чтобы изучить взаимосвязь между двумя антигенами, можно также локализовать несколько антигенов, используя продукты реакции разного цвета. К сожалению, часто считается, что методы множественного окрашивания предназначены только для исследователей с «золотыми руками», потому что эти методы часто сильно привязаны к конкретной цели, могут включать приготовление специальных реагентов и склонны к ложному смешанному окрашиванию. Эта работа содержит протоколы двойного иммуноферментного окрашивания для образцов тканей человека, которые могут быть выполнены с коммерчески доступными реагентами.Эти общие протоколы можно легко адаптировать ко многим различным приложениям и комбинациям антител. Внимание будет обращено на наиболее часто встречающиеся комбинации двойного окрашивания первичных антител: мышь – кролик, мышь – коза, мышь – мышь и кролик – кролик. Здесь будут обсуждаться проблемы, связанные с объединением двух мышиных антител, которые потенциально могут привести к нежелательным перекрестным реакциям.

Традиционно при использовании невооруженного глаза или любого типа камеры RGB для наблюдения результатов двойного окрашивания существенную роль играет хороший визуальный контраст между двумя продуктами ферментативной реакции.Если два антигена локализованы в одной и той же клеточной структуре (= колокализация), присутствует смешанный цвет, который должен иметь хороший контраст с двумя основными цветами. Для этого необходимо пойти на компромисс с выбором хромогена в отношении чувствительности / эффективности и микроскопического разрешения окрашенных продуктов реакции.

Спектральная визуализация с возможностью разделения мультиплексированных изображений лишь частично применяется для флуоресцентной микроскопии (Tsurui et al. 2000; Siboni et al.2001; Гринбаум и др. 2002; Weier et al. 2005). Работы, описывающие спектральную визуализацию образцов ткани в светлом поле, встречаются редко (Орнберг и др., 1999; Орнберг, 2001; Левенсон и Мэнсфилд, 2006). С введением спектральной визуализации светлопольных микроскопических образцов вся концепция контрастирования основных цветов и смешанных цветов резко изменилась. Основываясь на спектральных характеристиках продуктов реакции, спектральная визуализация предлагает большое преимущество, заключающееся в разделении рисунков двойного окрашивания на два изображения одиночного окрашивания, и визуальный контраст больше не является требованием (de Boer et al.2007а, б; Hoozemans et al. 2007; Scheper et al. 2007).

Традиционные комбинации хромогенов для двойного окрашивания

При наблюдении результатов двойного окрашивания невооруженным глазом комбинация хромогенов имеет большое значение, поскольку ключевым требованием является визуальный контраст. Особенно, когда основной целью является наблюдение за колокализацией, необходим оптимальный контраст между двумя основными цветами и смешанным компонентом. На протяжении истории ИГХ было предложено множество различных комбинаций хромогенов для двойного окрашивания (van der Loos, 1999), но только две оказались подходящими для прямого визуального наблюдения как отдельных хромогенов, так и смешанного цвета в местах колокализации: красно-синий (с коричнево-пурпурным промежуточным цветом) и бирюзово-красный (с сине-фиолетовым промежуточным цветом).

Комбинация красно-синего цвета состоит из активности щелочной фосфатазы (AP) в синем цвете с использованием Fast Blue BB / Napthhol-AS-MX-фосфата и активности пероксидазы хрена (HRP) в красном цвете с 3-амино-9-этилкарбазолом (Boorsma 1984; ван дер Лоос 1999). Оба продукта реакции растворяются в органической монтажной среде, поэтому здесь требуется водная фиксация. В качестве альтернативы можно использовать два коммерчески доступных хромогена от Vector Laboratories (Burlingame, CA): Vector Blue и Vector NovaRed (van der Loos 2005).Водная фиксация Vector Blue и NovaRed невозможна (NovaRed со временем исчезает!), Но органическая фиксация после полного высыхания образцов с использованием растворителя, не содержащего спирта и ксилола (VectaMount), дает отличные микроскопические результаты как с криостатными, так и с парафиновыми срезами ткани. . Контрастное окрашивание в сочетании с комбинацией красно-синего цвета необходимо тестировать для каждой комбинации антител. Наиболее очевидный выбор — это метиловый зеленый (0,1% в ацетатном буфере, pH 5,5), дающий слабозеленые ядра.Однако метиловый зеленый, по-видимому, связывается с красным продуктом реакции, меняя его цвет на коричневый. По сути, это снижает цветовой контраст, затрудняя наблюдение колокализации с помощью смешанных цветов. В некоторых случаях может быть достаточно слабого контрастного красителя эозина (окунуть в раствор эозина на 30 секунд, промыть в проточной водопроводной воде и проверить под микроскопом до получения оптимального результата) или слабого контрастного красителя Nuclear Red и дать слабое изображение неокрашенных элементов ткани. Проблема в красно-синей комбинации состоит в том, что синие продукты реакции AP (Fast Blue, Vector Blue) относительно нечувствительны и довольно диффузно локализованы по сравнению с продуктом пероксидазной реакции.Визуализация активности АР с помощью нитросинего тетразолия / 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата дает темно-синий пурпурный продукт реакции, который не позволяет наблюдать смешанный цвет.

Комбинация бирюзово-красного цвета состоит из активности β-галактозидазы (β-GAL) в бирюзовом и активности AP в красном (van der Loos et al. 1993). Активность β-GAL визуализируется с использованием 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-галактозида (X-gal) с солями цианида ферро-ферри-железа (Бонди и др., 1982). Этот продукт реакции очень стабилен и не растворяется в спиртах или других органических жидкостях.Активность AP можно визуализировать красным цветом, используя Fast Red TR, Fast Red Violet LB / Naphthol-AS-MX-phosphate (Boorsma 1984; van der Loos 1999) или другие коммерчески доступные методы визуализации красного AP. Чувствительный и элегантный в использовании (можно приготовить точное количество необходимого реагента!) Является Liquid Permanent Red (LPR) от Dako (Карпинтерия, Калифорния), который также позволяет органическое крепление после пропуска дегидратации в спиртах (сухие образцы на горячей плите и покровное стекло органически). Слабый синий контраст гематоксилина довольно хорошо контрастирует с основными цветами, но почти идентичен по цвету сине-пурпурному промежуточному цвету в местах колокализации.Проблема в комбинации бирюзово-красный заключается в том, что активность β-GAL, безусловно, гораздо менее чувствительна / эффективна и более диффузно локализована по сравнению с продуктами реакции HRP или активностью AP, выделенной красным.

В качестве альтернативы красно-зеленая комбинация может быть получена из зеленой активности HRP, визуализированной с помощью 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидина (TMB) / диоктилсульфосукцината натрия (Buckel and Zehelein 1981) и активности AP в красном (van der Loos et al. 1988). Бирюзово-зеленый продукт реакции довольно точен и очень чувствителен / эффективен; однако он не очень стабилен после нанесения на воду (Speel et al.1994). Из-за чрезвычайной чувствительности / эффективности этих хромогенов настоятельно рекомендуется тщательное титрование первичных и вторичных реагентов. Как правило, визуализация активности HRP на основе TMB, включая коммерчески доступные хромогены TrueBlue (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) и Vector TMB, считаются «трудными» и, похоже, не работают с каждым антителом в каждой ситуации. Научного объяснения этих противоречивых и непостоянных результатов пока нет.

Как мы видели здесь, и красно-синие, и бирюзово-красные цветовые комбинации имеют недостаток, заключающийся в том, что они содержат один диффузно локализованный и довольно нечувствительный / неэффективный хромоген: Fast Blue BB, Vector Blue в красно-синей комбинации и X-gal в бирюзово-красное сочетание. Этот недостаток приводит к необходимости повторного титрования первичных антител для ситуаций двойного окрашивания и делает невозможным успешное двойное окрашивание с антителами, которые показывают неясное и слабое окрашивание по своей природе или окрашивание крошечных клеточных компонентов.

Комбинация красно-коричневого цвета состоит из активности HRP с тетрагидрохлоридом диаминобензидина (DAB) в коричневом цвете и активности AP с LPR Dako в красном. Эта комбинация хромогенов обеспечивает две процедуры чувствительной / эффективной ферментативной визуализации с четким микроскопическим видом. Ядерное контрастирование гематоксилином не является обязательным. Для наблюдения невооруженным глазом эта цветовая комбинация десятилетиями применялась многими исследователями (Nakane 1968; Malik and Daymon 1982) и используется в нескольких коммерчески доступных системах двойного окрашивания.Комбинация красно-коричневого цвета в сочетании с визуальным наблюдением полезна только для отображения двух разных популяций или компонентов клеток без какого-либо перекрытия. Однако визуализация колокализации невозможна с этой цветовой комбинацией, потому что отсутствует визуально различимый красно-коричневый смешанный цвет (van der Loos, 1999).

Цветовые комбинации для спектральной визуализации

Из-за способности системы спектральной визуализации разделять хромогены, которые визуально почти не различимы, визуальный цвет продукта реакции больше не имеет значения.Таким образом, хромогены теперь могут быть выбраны для множественного окрашивания, которые являются чувствительными / эффективными, имеют четкую картину локализации и могут быть установлены органически, лучше всего подходя к парафиновым срезам ткани, а не по их свойствам визуальной оценки. Протоколы двойного окрашивания в этой работе основаны на комбинации коричнево-красного цвета: активность HRP в коричневом цвете с помощью усиленной версии DAB (DAB +; Dako) и активность AP в красном с помощью LPR (Dako) с ядерным контрастным окрашиванием синим цветом с использованием гематоксилина. .Чтобы показать мощность спектрального разделения, здесь показано, что даже четырехкратный IHC может быть разделен на четыре отдельных изображения. Четырехкратную ИГХ проводят, последовательно комбинируя две процедуры двойного окрашивания с промежуточным этапом извлечения эпитопа, индуцированного нагреванием (HIER), для удаления всех иммунореагентов из первой последовательности окрашивания (Lan et al. 1995). Во второй последовательности окрашивания используются AP-активность синего цвета с Vector Blue и активность HRP пурпурным с Vector VIP (Vector). Хотя визуальный контраст после многократного окрашивания довольно плох и совместная локализация смешанным цветом легко не заметить невооруженным глазом, эти продукты ферментативной реакции служат прекрасной основой для анализа многократного окрашивания с помощью спектральной визуализации.

Материалы и методы

Образцы тканей (миндалина, отторженный трансплантат почки) обычно фиксировали забуференным 4% формалином в течение не менее 48 часов и обычно обрабатывали до парафиновых блоков. Срезы размером 5 мкм вырезали и помещали на предметные стекла с покрытием и сушили в течение ночи при 37 ° C. Слайды депарафинизировали в ксилоле и гидратировали с использованием градуированных спиртов в водопроводную воду. Эндогенная пероксидазная активность в фиксированных формалином и залитых парафином срезах (FFPE) блокировалась 0,3% пероксидом в метаноле (20 мин, комнатная температура).Чтобы обеспечить хорошо сохранившуюся морфологию тканей во время HIER, этот этап был выполнен в модуле предварительной обработки (PTModule; Thermo Scientific / LabVision, Fremont, CA) (Gray et al. 2006) в течение 20 минут при 98 ° C с охлаждением до 65 ° C. Для оптимизации результатов окрашивания всех антител, участвующих в двойном окрашивании, были протестированы четыре раствора HIER (Shi et al. 1997): цитратный pH 6,0, EDTA pH 8,0, Tris-HCl + EDTA pH 9,0 и Tris-HCl pH 10,0 (Thermo Scientific / LabVision). После промывания проточной водой из-под крана применяли блок несывороточного белка на 15 мин при комнатной температуре (блок Ultra V; Thermo Scientific / LabVision).

Свежую ткань миндалин быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Срезы тканей криостата размером 5 мкм сушили в течение ночи при комнатной температуре, фиксировали холодным ацетоном (10 мин) и сушили на воздухе (2 мин). Эндогенная пероксидазная активность в срезах ткани криостата блокировалась с помощью забуференного трис-HCl физиологического раствора (TBS) + 0,3% пероксида и 0,1% азида натрия (10 мин, комнатная температура) (Li et al. 1987). После промывки TBS блокирующий белок не сыворотки применяли на 15 мин при комнатной температуре (Ultra V Block; Thermo Scientific / LabVision).Первичные антитела, использованные в этом исследовании, перечислены в. Все остальные иммунореагенты, соответствующие общим протоколам — перечислены в.

Таблица 1

Первичные антитела, использованные в этом исследовании

Mouse Cl9 UK 9066 DG6-G2a 9066 DG6 906 906 906 906 906 906 Gb6 Мышиный IgG1
Антитело Виды Клон Поставщик
Foxp3
CD3 Rabbit Clone SP7 Thermo / LabVision
CD20 Mouse IgG1 Clone L26 Thermo / LabVision Thermo / LabVision
CD8 Мышиный IgG1 Клон C8 / 144B Dako
Granzyme B-7 Мышиный IgG2a 9070 Клон ACT-1 Dako
CD68 Мышиный IgG3 9067 0 Клон PG-M1 Dako
CD3, FITC Мышиный IgG1 Клон SK7 BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния

Вторичные хромогенные агенты,

Таблица 2

использованный в этом исследовании

90 669 1:50 Осел против козьего IgG / биотина a d Biotech 9 9 70 9 9066 9066 6 Комплект Liquid Permanent Red
Реагент Разбавление Поставщик Код
Полимер антимышиный / HRP Неразбавленный Thermo670 / LabVision
Полимерный антимышиный / AP Неразбавленный Thermo / LabVision TL-017-AFJ-M
Полимерный анти-кролик / HRP Неразбавленный Thermo7017 90 -66 ADJ -R
Полимерный антикроличий / AP Неразбавленный Thermo / LabVision TL-017-AFJ-R
Ослиный анти-козий IgG / AP a Джексон c 705-055-147
Ослиный анти-козий IgG / HRP a 1: 100 Джексон 705-035-147
1: 200 Джексон 705-065-147
Кролик против козьего Ig 1: 5000 Dako Z06454 4 Нормальный козья сыворотка 1:10 Dako X0907
Нормальная мышиная сыворотка 1:10 Dako X0910
Rabbit Anti-FITC 4510-7804
Стрептавидин / АП 1: 100 Дако D0396
Стрептавидин / HRP 1: 400 9 Козий антимышиный IgG1 / AP b 1:50 Southern Biotech e 1070-04
Козий антимышиный IgG1 / HRP b 1: 100 1070-05
Козий антимышиный IgG1 / биотин b 1: 100 Southern Biotech 1070-08
Козий антимышиный Ig / AP Dako D0486
Козий антимышиный Ig / HRP 1: 100 Dako P0447
Козий анти-кроличий Ig / AP
Dako DK
Козий анти-кроличий Ig / HRP 1: 100 Dako P0448
Система блокирования эндогенного биотина Dako ARC Dako K3954
Набор для усиления сигнала тирамида (CSA II) Dako K1497
Диаминобензидинтетрагидрохлорид +
Dako K0640
Vector Blue Vector Labs SK-4300
Vector VIP 9 Vector 9066 Гематоксилин Mayers 1:10 Dako S3309
VectaMount Vector Labs H-5000

Двойное окрашивание мышь – кролик.

Непрямое двойное окрашивание козы – мыши.

Многоступенчатое двойное окрашивание коза – мышь.

Последовательное двойное окрашивание мышь – мышь.

Двойное окрашивание мышь – мышь, разные подклассы IgG.

Двойное окрашивание мышь – мышь, сочетающее высокочувствительную амплификацию тирамида и низкочувствительное непрямое окрашивание.

Мышь – мышь / непрямое прямое многоступенчатое двойное окрашивание FITC.

Набор для исследования мыши – мыши / животных (ARK) — непрямое прямое многоступенчатое двойное окрашивание биотином после мечения ARK-биотином.

Антитела и конъюгаты разводили в TBS + 1% BSA (Sigma, Сент-Луис, Миссури), и TBS использовали в качестве промывочного буфера для всех последующих этапов (трижды по 3 мин). С этого момента протокол двойного окрашивания, включая ферментативную визуализацию, выполнялся, как описано в разделе «Протоколы двойного окрашивания» и схематично представлено в -. Дважды окрашенные образцы контрастировали с использованием разбавленного 1:10 гематоксилина (в водопроводной воде), обеспечивающего умеренное, но по существу прозрачное ядерное окрашивание.Образцы сушили на горячей плите (50 ° C) и наносили органическим способом (без спирта или ксилола) VectaMount (Vector).

Образцы наблюдали с помощью микроскопа Leica BM5000 (Leica Microsystems; Вецлар, Германия) с системой многоспектральной визуализации Nuance VIS-FL (Cambridge Research Instrumentation; Woburn, MA), соединенной с помощью стандартного крепления 1 × c. Спектры получали от 460 до 660 нм с интервалами 10 нм. Для анализа использовалось программное обеспечение Nuance версии 2.4.

Протоколы двойного окрашивания

Протокол процедуры двойного окрашивания сильно зависит от комбинации первичных антител в отношении вида животных, изотипа Ig, подкласса мышиного IgG или прямого мечения.Обычно исследователи сначала проводят однократное окрашивание, а затем выбирают лучшие комбинации антител для двойного окрашивания. Эта стратегия означает, что протокол двойного окрашивания должен состоять из основных цветов, которые ранее были оптимизированы для однократного окрашивания. Следовательно, процедура двойного окрашивания должна быть разработана на основе характеристик первичных антител. В следующем разделе обсуждаются преимущества, недостатки и проблемы с регулярно встречающимися первичными комбинациями мышь – кролик, мышь – коза, мышь – мышь и кролик – кролик.

Комбинация мышь-кролик

Комбинация первичных антител мышь-кролик является самой простой процедурой двойного окрашивания с технической точки зрения. Комбинация первичных антител, а затем обоих вторичных антител с последующей визуализацией активности AP и активности HRP делает эту процедуру короткой и удобной для пользователя. Осенью 2007 года Thermo Scientific / LabVision представила систему набора MultiVision для окрашивания комбинации первичных антител кролика и мыши, включающей красный и синий хромогены.Многие комбинации двойного окрашивания могут состоять из любого моноклонального антитела мыши в сочетании с классическим поликлональным антителом кролика или одним из недавно введенных коммерчески доступных моноклональных антител кролика (Rossi et al. 2005). Система обнаружения, не содержащая биотина, применяется с использованием одновидовых антимышиных и антикроличьих полимеров, связанных с ферментами HRP или AP (Sabattini et al. 1998). Поскольку все анти-мышиные и антикроличьи полимеры содержат вторичные антитела козьего происхождения, проблема межвидовой перекрестной реакции отсутствует.показывает общий протокол и принципиальную схему. Номера шагов на схематической диаграмме относятся к номерам шагов в протоколе.

Комбинация мышь – коза

В основном комбинация первичных антител мыши и козы аналогична ситуации мышь – кролик: два первичных антитела разных видов. Когда не ожидается никаких проблем с эндогенным биотином и не требуется более высокая чувствительность к окрашиванию / эффективность полимеров, можно использовать традиционные конъюгаты, полученные на осле, в качестве вторичных антител против мыши или козла, непосредственно меченных АР, HRP или биотином (Джексон; West Grove , PA) ().При использовании антител, конъюгированных с биотином, следует проявлять осторожность, чтобы блокировать эндогенный биотин (Wood and Warnke 1981). Однако блокирование эндогенного биотина в некоторых тканях (печень, почки, селезенка) после HIER с использованием Tris-EDTA pH 9,0 может быть безуспешным (Vyberg and Nielsen 1998). Особая проблема возникает, когда для большей чувствительности / эффективности требуется система обнаружения полимеров, не содержащих биотина. Поскольку все антимышиные полимеры содержат антитела, полученные от коз, перекрестная реакция с системой обнаружения коз очень очевидна.В качестве альтернативы можно успешно применить многоступенчатый подход с промежуточным этапом блокировки (). В этом многоэтапном протоколе активность HRP может развиваться после шага 3 (вариант 1) или в качестве последнего шага хромогена (вариант 2). Вариант 2 является предпочтительным, но он может привести к слабому или даже отрицательному результату окрашивания HRP.

На сегодняшний день доступны антикозьи полимеры, но неизвестно, в каких видах антикозьи антитела вырабатываются (Invitrogen / Zymed; Carlsbad, CA и BioCare; Concord, CA).Без надлежащего знания хозяина эти полимеры могут неожиданно перекрестно реагировать с другими видами, участвующими в последовательности окрашивания, и поэтому они не подходят для этого типа двойного окрашивания.

Комбинации мышь-мышь или кролик-кролик

Поскольку многие антитела имеют мышиное моноклональное происхождение, очевидно, что регулярно требуется комбинация мышь-мышь. Было опубликовано несколько успешных процедур двойного окрашивания, посвященных основной проблеме перекрестной реакции между двумя системами обнаружения против мышей.

  1. Последовательное двойное окрашивание, объединяющее два немеченых антитела мыши или кролика в двух отдельных последовательностях обнаружения (). Чтобы предотвратить перекрестную реакцию между двумя окрашивающими последовательностями, исследователи сначала удалили иммунореагенты из первой окрашивающей последовательности буферами с низким pH. Эта стадия оставляет нетронутым окрашенный продукт реакции (Nakane 1968). Было предложено несколько методов для этого удаления (буферы с экстремальным pH, высокое содержание соли, электрический ток), но ни один из них не был успешным в удалении высокоаффинных первичных антител (Tramu et al.1978). Впоследствии было показано, что перекрестная реакция между реагентами, используемыми в первой и второй последовательности окрашивания, предотвращается путем использования DAB в качестве хромогена после первой последовательности окрашивания. Утверждается, что коричневый продукт реакции DAB является единственным известным хромогеном, который эффективно покрывает иммунореагенты от первой последовательности окрашивания и, следовательно, предотвращает перекрестные реакции (Sternberger and Joseph 1979). Однако в случае, если оба антигена находятся в непосредственной близости, эффективное укрытие продуктом реакции DAB может также укрывать второй антиген (Valnes and Brandtzaeg 1984).Было доказано, что титрование первого первичного антитела является важным ключевым фактором для успешного проведения последовательного двойного окрашивания. Слишком высокая концентрация первого первичного антитела может привести к неполному укрыванию продуктом реакции DAB, что приведет к нежелательным перекрестным реакциям со второй последовательностью окрашивания (van der Loos, неопубликованные данные). Как правило, последовательное двойное окрашивание применяется для идентификации двух разных типов клеток или компонентов клеток. Не рекомендуется для наблюдения колокализации по смешанным цветам.Контрольные эксперименты необходимы для безопасного проведения этого типа двойного окрашивания.

  2. Последовательное двойное окрашивание со стадией HIER между двумя последовательностями окрашивания описано Lan et al. (1995). Доказано, что эта стадия нагревания эффективна даже для удаления высокоаффинных первичных антител и может быть объединена с любым типом хромогена, который выживает после стадии нагревания. Это позволяет комбинировать хромогены по собственному выбору и может обойти использование DAB.

  3. Непрямой / непрямой протокол, основанный на двух мышиных моноклональных первичных антителах разного типа Ig (IgG – IgM) или разных подклассов IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3;) (Tidman et al. 1981). Поскольку почти 90% всех мышиных моноклональных антител относятся к подклассу IgG1, этот протокол непрямого / непрямого двойного окрашивания может применяться лишь в редких случаях. Высококачественные реагенты второго этапа, специфичные для изотипа IgG мыши, меченные различными ферментами, флуорохромами или биотином, можно найти в Southern Biotech Associates (Бирмингем, Алабама).Как и в случае непрямого / непрямого двойного окрашивания с использованием антител различных видов животных, этот тип двойного окрашивания также может быть выполнен путем применения смеси двух первичных антител и смеси двух вторичных антител. На сегодняшний день для этого типа обнаружения нет полимеров.

  4. Характеристики первого немеченого первичного антитела при очень высоком разведении с последующей высокочувствительной / эффективной амплификацией тирамида и второго немеченого первичного антитела, визуализированного с помощью протокола относительно низкочувствительного / эффективного IHC-обнаружения.Высокое разбавление первого первичного вещества запрещает перекрестную реакцию со второй системой обнаружения. Если какой-либо компонент второй системы обнаружения присоединяется к компонентам первой системы обнаружения, он остается ниже уровня обнаружения и не будет виден. Этот метод был впервые описан с помощью флуорохромов (Brouns et al. 2002), а недавно — с ферментативными маркерами (van der Loos, 2006) (). Очевидно, что для безопасной интерпретации результатов, полученных с помощью этого типа двойного окрашивания, необходимы контрольные эксперименты.

  5. Непрямой / прямой многоэтапный протокол, объединяющий немеченое первичное антитело мыши со вторым первичным антителом мыши, которое непосредственно конъюгировано (флуорохром, гаптен, биотин или фермент). Многоступенчатая процедура начинается с немеченого первичного антитела, например, детектируемого с помощью меченного ферментом антимышиного полимера. Затем применяется этап нормального блокирования мышиной сыворотки для насыщения всех сайтов связывания антимышиных. После прямого конъюгирования второго первичного антитела мыши последующее обнаружение проводят с (непрямым) меченным ферментом антифлуорохромом или гаптеном или меченным ферментом стрептавидином () (van der Loos et al.1989; ван дер Лоос 1999). Таким образом, непосредственно меченые первичные антитела коммерчески доступны в основном для целей системы сортировки флуоресцентных клеток, и многие из этих конъюгатов флуорохромов могут также работать в IHC. Применимость этой многоступенчатой ​​процедуры двойного окрашивания была отмечена в нескольких публикациях нашей группы (Naruko et al. 1996; de Boer et al. 1997; Hosono et al. 2003).

  6. Если нет доступных напрямую конъюгированных первичных антител мыши, можно использовать систему маркировки in vitro набора для исследования животных (ARK).ARK обеспечивает биотинилированный Fab-фрагмент антимышиного IgG (реагент биотинилирования), который in vitro смешивают с первичным антителом (15 мин, комнатная температура). После блокирования несвязанного реагента биотинилирования нормальным мышиным IgG (5 мин, комнатная температура) готовое к использованию биотинилированное первичное антитело может быть применено в многоступенчатом непрямом / прямом протоколе, как описано выше (van der Loos and Göbel 2000) () . Поскольку ARK содержит Fab-фрагмент антимыши, эта опция недоступна для основных видов, выращенных у других видов.

Расширение до тройного или четырехкратного ИГХ

Любая комбинация подходящих комбинаций двойного окрашивания, описанная выше, может быть применена для настройки четырехкратного ИГХ. Первая последовательность окрашивания заканчивается развитием активности HRP с DAB + в коричневом цвете и активности AP с LPR в красном. Чтобы удалить все иммунореагенты, участвующие в первой последовательности окрашивания, образцы подвергали второй обработке HIER (Lan et al. 1995) с использованием выбранного буфера, наиболее подходящего для второй пары первичных антител.Очевидно, что эта вторая процедура HIER подходит только для срезов FFPE, а не для срезов тканей криостата, фиксированных ацетоном. Обработка HIER в течение 10 минут при 98 ° C оказалась достаточной для удаления всех антител. Оставшаяся активность AP не выдерживает второй обработки HIER, а оставшаяся активность HRP блокируется 3% перекисью в TBS. Вторая процедура двойного окрашивания включала окрашивание активности AP синим (Vector Blue) и активности HRP фиолетовым (Vector VIP) в указанном порядке. Для трехкратного окрашивания ИГХ применяется только Vector VIP.Контрольные эксперименты по мониторингу потенциальной перекрестной реакции между двумя процедурами двойного окрашивания состояли из полной процедуры четырехкратного окрашивания ИГХ, но без второй пары первичных антител.

Результаты

После двойного окрашивания коричневые и красные продукты реакции от активности HRP (DAB +) и AP (LPR) визуально не контрастировали. Колокализация по смешанным цветам распознать исключительно сложно. Контрольные эксперименты по замене одного или обоих первичных антител на неиммунные Ig того же вида, изотипа Ig, подкласса IgG и концентрации дали стойкие отрицательные результаты.Эти образцы с «половинным двойным окрашиванием» служили контрольным образцом для получения индивидуальных спектров с помощью системы спектральной визуализации Nuance. Индивидуальные спектры DAB +, LPR и гематоксилина в диапазоне от 460 до 660 нм, полученные из этих однократно окрашенных образцов и использованные в качестве спектральной библиотеки, изображены на и. После загрузки этой спектральной библиотеки программное обеспечение Nuance используется для разделения кубов спектральных данных, полученных из дважды окрашенных образцов, в три отдельных монохромных изображения в градациях серого, каждое из которых показывает распределение и содержание одного из хромогенов.Псевдоцветное составное изображение отображается в режиме имитации флуоресценции для оптимального визуального контраста. Таким образом, это разделение было выполнено с тремя комбинациями антител плюс ядерный контраст, как показано на -.

Вкладка Spectra из программного обеспечения Nuance (версия 2.4), на которой показаны индивидуальные спектры Liquid Permanent Red (LPR) -сильный (красный), LPR-weak (пурпурный), диаминобензидинтетрагидрохлорид (DAB) -сильный (зеленый), DAB-weak (желтый) и гематоксилин (синий) от 460 до 660 нм.Обратите внимание на явное различие между спектрами DAB-сильного продукта реакции и DAB-слабого, тогда как разница между LPR-сильным и LPR-слабым минимальна.

Вкладка «Спектры» программного обеспечения Nuance (версия 2.4), на которой показаны отдельные спектры LPR (красный), DAB (зеленый), Vector Blue (желтый) и Vector VIP (синий) от 460 до 660 нм.

Микроскопическая деталь гиперпластической миндалины (человека), показывающая двойное иммуноферментное окрашивание антителами CD3 (кроличий моноклональный SP7) и Foxp3 (клон мыши 236A / E7) на фиксированном формалином, залитом парафином (FFPE) срезе ткани.Протокол непрямого / непрямого двойного окрашивания основан на первичных антителах разных видов животных (). ( A ) RGB-изображение исходного среза ткани FFPE, показывающее CD3 коричневым (DAB +), Foxp3 красным (LPR) и ядерное контрастное окрашивание синим (гематоксилин). После разделения с помощью спектральной визуализации составное флуоресцентное изображение в псевдоцветах четко показывает присутствие Foxp-3 (красный) -положительных ядер в CD3 (зеленых) Т-клетках (детали во вставке в рамке в B ). ( C – E ) Отдельные слои после размешивания; CD3 ( C ), Foxp-3 ( D ) и гематоксилин ( E ).Пруток = 0,1 мм.

Микроскопическая деталь отторженного трансплантата почки (человека), показывающая двойное иммуноферментное окрашивание с помощью антител CD8 (мышиный клон C8 / 144, IgG1) и Granzyme B-7 (мышиный клон GrB-7, IgG2a) на срезе ткани FFPE. Протокол непрямого / непрямого двойного окрашивания основан на различии подклассов мышиного IgG (). ( A ) RGB-изображение исходного среза ткани FFPE, показывающее CD8 коричневым (DAB +), GrB-7 красным (LPR) и ядерное контрастное окрашивание синим (гематоксилин). После разделения с помощью спектральной визуализации составное флуоресцентное изображение в псевдоцветах четко показывает совместную локализацию GrB-7-положительных гранул (красный) с CD8 (зеленые) Т-лимфоциты (стрелки), идентифицируя эти клетки, показывающие совместную локализацию как цитотоксические Т-клетки. ячеек ( B ).Одноположительные клетки GrB-7 являются естественными клетками-киллерами. ( C – E ) Отдельные слои после размешивания; CD8 ( C ), GrB-7 ( D ) и гематоксилин ( E ). Пруток = 0,1 мм.

Микроскопическая деталь гиперпластической миндалины (человека), показывающая двойное иммуноферментное окрашивание с CD25, рецептором интерлейкина-2 (мышиный клон ACT-1) и FITC-конъюгированным CD3 (мышиный моноклональный SK7) на фиксированном ацетоном срезе ткани криостата. Протокол непрямого / прямого многоэтапного двойного окрашивания основан на одном немеченом первичном и одном первичном антителе, конъюгированном с FITC ().( A ) RGB-изображение исходного среза ткани, показывающее Т-клетки с CD3 коричневым (DAB +) и CD25 красным (LPR). После разделения со спектральной визуализацией составное флуоресцентное изображение в псевдоцветах четко показывает присутствие активированных Т-клеток, отмеченных колокализацией CD3 – CD25 (красный и зеленый сливаются с желтым). Покоящиеся Т-клетки остаются однократно окрашенными (зеленым), а субпопуляция макрофагов остается однократно окрашенной (красным). ( C ) CD3 Т-клетки и ( D ) CD25 показывают отдельные слои после разделения.( E ) Результирующее изображение логической операции «и» с изображениями C и D . Обратите внимание, что это изображение показывает исключительно совместную локализацию CD3 – CD25, аналогичную желтым клеткам в B . Пруток = 0,1 мм.

Расширение двойного IHC окрашивания до четырехкратного окрашивания может быть выполнено с использованием LPR и DAB + в первой последовательности окрашивания, за которой следует второй этап HIER. Продукты реакции как LPR, так и DAB выдерживают стадию нагревания в неизменном виде. После завершения четырехкратного окрашивания хромогенами Vector Blue и Vector VIP четыре продукта реакции могут быть спектрально несмешаны с использованием спектральной библиотеки, изображенной на.Из этого ясно, что четырехкратное окрашивание CD3, CD20, CD68 и CD34 показывает исключительно Т-клетки, В-клетки, макрофаги и эндотелиальные клетки соответственно. Спектральная визуализация не выявляет какого-либо перекрытия между этими четырьмя антителами, как это не ожидается для этих четырех разных типов клеток в гиперпластической миндалине. Контроли, включающие все этапы четырехкратной процедуры ИГХ, с исключением второй пары первичных антител, не показали какого-либо окрашивания Vector Blue и Vector VIP. Таким образом, это указывает на отсутствие остаточной активности AP или HRP и перекрестной реактивности между двумя процедурами двойного окрашивания.

Микроскопическая деталь гиперпластической миндалины (человека), демонстрирующая четырехкратное иммуноферментное окрашивание с помощью CD3 (кроличий моноклональный SP7), CD20 (клон мыши L26), CD68 (клон мыши PG-M1, IgG3) и CD34 (клон мыши QBend10, IgG1) антитела на срезе ткани FFPE. Сначала выполняется протокол непрямого / непрямого двойного окрашивания на основе первичных антител различных видов животных () с CD3 и CD20. Затем срез подвергают второй процедуре извлечения эпитопа, индуцированной нагреванием, для удаления иммунореагентов из первой процедуры двойного окрашивания.Затем выполняется второй протокол непрямого / непрямого двойного окрашивания на основе различия подклассов IgG мыши () с CD68 и CD34. ( A ) RGB-изображение исходного среза ткани, показывающее Т-клетки с CD3 коричневым (DAB +), В-клетки с CD20 красным (LPR), макрофаги синим (вектор синий) и эндотелий фиолетовым (вектор VIP). Обратите внимание на умеренную интенсивность окрашивания используемых хромогенов. После разделения со спектральной визуализацией составное флуоресцентное изображение в псевдоцветах четко показывает присутствие Т-клеток (зеленый), В-клеток (красный), макрофагов (желтый) и эндотелия (синий) ( B ).( C – F ) Отдельные слои после размешивания. Пруток = 0,1 мм.

Обсуждение

Как и ожидалось, комбинация коричнево-красного цвета, состоящая из четких продуктов реакции от активности HRP (DAB +) и AP (LPR) плюс ядерное контрастное окрашивание гематоксилином, бесполезна для наблюдения колокализации невооруженным глазом. Однако такая цветовая комбинация является хорошей основой для успешного двойного окрашивания с использованием спектральной визуализации, поскольку визуальный цветовой контраст больше не важен.Основываясь на различных спектральных характеристиках обоих хромогенов и ядерного контрастного окрашивания, можно спектрально разделить исходное наблюдение на три разных изображения, каждое из которых отображает распределение и содержание отдельного хромогена. Программное обеспечение упрощает визуализацию этих различных изображений, создавая составное изображение в разных слоях, которые можно включать и выключать независимо. Кроме того, это составное изображение может отображаться в режиме имитации флуоресценции, что может помочь в визуальной оценке.Это кажется полезным для изучения колокализации. В этом контексте также можно показать совместную локализацию с помощью подключаемого модуля Multiple Marker Molecular в программном обеспечении Nuance 2.4 или импортировать два отдельных изображения после разделения в расширенное программное обеспечение для обработки изображений (например, Image-Pro Plus, версия 5.0; Media Cybernetics, Bethesda, MD) и выполните логическую операцию AND с пороговым значением. Результирующее новое изображение () отображает только те пиксели, которые демонстрируют колокализацию, тогда как одиночное окрашивание здесь не видно (de Boer et al.2007а).

Успех разделения продуктов реакции DAB и LPR зависит от интенсивности окрашивания окрашенных продуктов реакции. Абсолютным условием успешной спектральной визуализации является относительная прозрачность (или низкая оптическая плотность) окрашенных продуктов реакции. Это особенно верно для DAB, продукт реакции которого страдает от проблемы, заключающейся в том, что он засоряется при высокой интенсивности окрашивания, что приводит к образованию темно-коричневого налета. Этот темно-коричневый продукт реакции имеет другие спектральные характеристики по сравнению с прозрачным желто-коричневым продуктом реакции.Например, темные отложения DAB будут «пропущены» после размешивания с использованием спектра, созданного из умеренных желто-коричневых отложений DAB. Более того, спектры от любых темных отложений хромогена имеют тенденцию быть похожими и, следовательно, будут «перетекать» в другие слои хромогена после спектрального разделения.

Коричневый продукт реакции DAB не является истинным поглотителем света, а является его рассеивателем и имеет очень широкий безликий спектр (). Это означает, что DAB не следует закону Бера-Ламберта, который описывает линейную зависимость между концентрацией соединения и его поглощением или оптической плотностью.Как следствие, темноокрашенный DAB имеет другую спектральную форму, чем слабоокрашенный DAB. Кроме того, этот тип спектра иногда трудно отличить от других спектров светорассеивающих материалов с помощью программного обеспечения Nuance. Например, спектр DAB аналогичен спектру меланина, и их трудно не смешивать (van der Loos, неопубликованные данные). Напротив, продукт реакции LPR является истинным поглотителем света и подчиняется закону Бера-Ламберта.

Наличие разных спектров при разной интенсивности окрашивания хромогена также создает потенциальную проблему с количественной оценкой результатов иммуноокрашивания.В этом отношении хромоген DAB менее подходит для количественной оценки, чем, например, LPR, который показывает очень похожие спектры при высокой и низкой интенсивности окрашивания (), как и ожидается от соединения, которое следует закону Бера-Ламберта.

Опасения по поводу продукта реакции DAB, упомянутые выше, безусловно, не исключают DAB из применения для двойного окрашивания, не смешанного с помощью спектральной визуализации. Его четкий продукт реакции идеален для хорошего микроскопического разрешения, а интенсивности темно-коричневого окрашивания можно легко избежать, разбавив первичное представляющее интерес антитело.Кроме того, наблюдается, что другие хромогены HRP (3-амино-9-этилкарбазол, Vector NovaRed) имеют те же проблемы, что и продукт реакции DAB (van der Loos, неопубликованные данные).

В этом исследовании три разных хромогена (DAB, LPR, гематоксилин) можно было просто разделить с помощью спектральной визуализации. Таким образом, возникает вопрос, будет ли спектральное несмешивание работать для комбинаций четырех или пяти цветов. Поскольку продукты ферментативной реакции визуализируются один за другим, наслоение большего количества хромогенов может привести к общему «потемнению» образца.Таким образом, это не соответствует описанной выше концепции, согласно которой спектральная визуализация идеально работает с прозрачными хромогенами. Однако, как ни удивительно, первые тесты с четырехкратным ИГХ, состоящим из LPR и DAB + (в первой последовательности) и Vector Blue и Vector VIP (во второй последовательности), показали, что спектральное несмешивание возможно при умеренной интенсивности окрашивания отдельных хромогенов. применяемый. Однако создание протоколов тройного и четырехкратного ИГХ окрашивания унаследовало многие технические проблемы (van der Loos, 1999).Наиболее многообещающим представляется метод последовательного множественного окрашивания, в котором иммунореагенты из первой процедуры двойного окрашивания удаляются с помощью этапа HIER (Lan et al. 1995; Van den Brink et al. 2000) и продолжают либо однократное окрашивание (для тройного IHC), либо еще одна процедура двойного окрашивания (для четырехкратного ИГХ). показывает, что, хотя антитела от одного и того же вида участвуют в первой и второй последовательности двойного окрашивания, не было обнаружено перекрывающихся образцов окрашивания из-за перекрестной реактивности.

В заключение, спектральная визуализация является важным преимуществом для анализа образцов с множественным иммуноферментным окрашиванием. Всякий раз, когда применяются хромогены, обеспечивающие умеренную интенсивность окрашивания, многократное окрашивание может быть полностью исключено в отдельных изображениях TIF. Эти отдельные изображения могут быть подвергнуты стандартным процедурам визуализации, а совместная локализация может быть визуализирована исключительно с помощью логической операции «И». Хорошие методы множественного окрашивания, до четырех различных маркеров, в сочетании со спектральным анализом изображений, открывают путь к пониманию более сложных взаимосвязей во всех видах клеточных процессов.

Благодарности

Автор благодарит Олтона Д. Флойда, доктора философии (Эдвардсбург, Мичиган), и Джима Р. Мэнсфилда (CRi, Воберн, Массачусетс) за полезные предложения и критическое прочтение этой рукописи.

Ссылки

  • Bondi A, Chieregatti G, Eusebi V, Fulcheri E, Bussolatti G (1982) Использование β-галактозидазы в качестве индикатора в иммуногистохимии. Histochemistry 76: 153–158 [PubMed]
  • Boorsma DM (1984) Прямое иммуноферментное двойное окрашивание, применимое для моноклональных антител.Histochemistry 80: 103–106 [PubMed]
  • Brouns I, Van Nassauw L, Van Genechten J, Majewski M, Scheuermann DW, Timmermans JP, Adriaensen D (2002) Тройное иммунофлуоресцентное окрашивание антителами, индуцированными у тех же видов изучить сложный паттерн иннервации внутрилегочных хеморецепторов. J Histochem Cytochem 50: 575–582 [PubMed]
  • Buckel P, Zehelein E (1981) Экспрессия Pseudonomas fluorescens D-галактозодегидрогеназы в E.coli . Gene 16: 149–159 [PubMed]
  • de Boer OJ, Hirsch F, van der Wal AC, van der Loos CM, Das PK, Becker AE (1997) Костимулирующие молекулы в атеросклеротических бляшках человека: указание на активация антигенспецифических Т-лимфоцитов. Атеросклероз 133: 227–234 [PubMed]
  • de Boer OJ, van der Loos CM, Teeling P, van der Wal AC, Teunissen MB (2007a) Иммуногистохимический анализ регуляторных маркеров Т-клеток FOXP3 и GITR на CD4 + CD25 + Т-клетки в нормальной коже и воспалительных дерматозах.J Histochem Cytochem 55: 891–898 [PubMed]
  • de Boer OJ, van der Meer JJ, Teeling P, van der Loos CM, van der Wal AC (2007b) Низкое количество FOXP3-положительных регуляторных Т-клеток присутствует на всех стадиях развития атеросклеротических бляшек человека. PLoS ONE 2: e779. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Gray DS, Selbie D, Cooper RF, Williams M, Robson G, Doyle E (2006) Одновременная депарафинизация и стандартизация поиска антигенов в иммуногистохимии с использованием имеющегося в продаже оборудования.Иммуноцитохимия 4: 93–97
  • Гринбаум Л., Шварц Д., Малик З. (2002) Спектрально-разрешенная микроскопия трафика GFP. J Histochem Cytochem 50: 1205–1212 [PubMed]
  • Hoozemans JJ, van Haastert ES, Eikelenboom P, de Vos RA, Rozemuller JM, Scheper W (2007) Активация развернутого белкового ответа при болезни Паркинсона. Biochem Biophys Res. Commun. 354: 707–711 [PubMed]
  • Хосоно М., де Бур О. Дж., Ван дер Валь А. К., ван дер Лоос К. М., Тилинг П., Пик Дж. Дж., Уеда М. и др.(2003) Повышенная экспрессия маркеров активации Т-клеток (CD25, CD26, CD40L и CD69) в образцах атерэктомии пациентов с нестабильной стенокардией и острым инфарктом миокарда. Атеросклероз 168: 73–80 [PubMed]
  • Lan HY, Mu W, Nikolic-Paterson DJ, Atkins RC (1995) Новый, простой, надежный и чувствительный метод множественного иммуноферментного окрашивания: использование микроволновой печи нагревание для блокирования перекрестной реактивности антител и извлечения антигенов. J Histochem Cytochem 43: 97–102 [PubMed]
  • Левенсон Р.М., Мэнсфилд Дж. Р. (2006) Мультиспектральная визуализация в биологии и медицине: срезы жизни.Cytometry A 69: 748–758 [PubMed]
  • Li CY, Ziesmer SC, Lazcano-Villareal O (1987) Использование азида и перекиси водорода в качестве ингибитора эндогенной пероксидазы в иммунопероксидазном методе. J Histochem Cytochem 35: 1457–1460 [PubMed]
  • Малик Н.Дж., Даймон М.Э. (1982) Улучшенное двойное иммуноферментное мечение с использованием щелочной фосфатазы и пероксидазы хрена. J Clin Pathol 35: 1092–1094 [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Nakane PK (1968) Одновременная локализация нескольких тканевых антигенов с использованием метода антител, меченных пероксидазой: исследование гипофиза на крысах.J Histochem Cytochem 16: 557–560 [PubMed]
  • Наруко Т., Уэда М., ван дер Вал А.С., ван дер Лоос К.М., Ито Х., Накао К., Беккер А.Е. (1996) Натрийуретический пептид С-типа в атеросклеротические поражения коронарных артерий человека. Circulation 94: 3103–3108 [PubMed]
  • Ornberg RL (2001) Измерения пролиферации и апоптоза с помощью анализа цветных изображений на основе дифференциального поглощения. J Histochem Cytochem 49: 1059–1060 [PubMed]
  • Орнберг Р.Л., Вернер Б.М., Эдвардс Д.А. (1999) Анализ окрашенных объектов в гистологических срезах с помощью спектральной визуализации и дифференциального поглощения.J. Histochem Cytochem 47: 1307–1314 [PubMed]
  • Росси С., Лаурино Л., Фурланетто А., Чинеллато С., Орвието Е., Канал Ф, Факкетти Ф и др. (2005) Кроличьи моноклональные антитела: сравнительное исследование новой категории иммунореагентов и соответствующих моноклональных антител мыши. Am J Clin Pathol 124: 295–302 [PubMed]
  • Sabattini E, Bisgaard K, Ascani S, Poggi S., Piccioli M, Ceccarelli C, Pieri F, et al. (1998) Система EnVision ++: новый иммуногистохимический метод диагностики и исследований.Критическое сравнение с методами APAAP, ChemMate, CSA, LABS и SABC. J Clin Pathol 51: 506–511 [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Scheper W, Hoozemans JJ, Hoogenraad CC, Rozemuller AJ, Eikelenboom P, Baas F (2007) Rab6 увеличивается при болезни Альцгеймера в мозге и коррелирует со стрессом эндоплазматического ретикулума. Neuropathol Appl Neurobiol 33: 523–532 [PubMed]
  • Shi SR, Cote RJ, Taylor CR (1997) Иммуногистохимия поиска антигена: прошлое, настоящее и будущее.J Histochem Cytochem 45: 327–343 [PubMed]
  • Siboni G, Rothmann C, Ehrenberg B, Malik Z (2001) Спектральная визуализация MC540 во время дифференцировки клеток карциномы толстой кишки мыши и человека. J Histochem Cytochem 49: 147–153 [PubMed]
  • Speel EJ, Jansen MP, Ramaekers FC, Hopman AH (1994) Новая процедура трехцветного детектирования для светлопольной микроскопии, сочетающая гибридизацию in situ с иммуноцитохимией. J Histochem Cytochem 42: 1299–1307 [PubMed]
  • Sternberger LA, Joseph SA (1979) Метод немеченых антител.Окрашивание парных гормонов гипофиза контрастным цветом без удаления антител. J Histochem Cytochem 27: 1424–1429 [PubMed]
  • Tidman N, Janossy G, Bodger M, Granger S, Kung PC, Goldstein G (1981) Определение путей дифференцировки тимоцитов человека с использованием методов двойного окрашивания моноклональными антителами . Clin Exp Immunol 45: 457–467 [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • Tramu G, Pillez A, Leonardelli J (1978) Эффективный метод элюции антител для последовательной или одновременной локализации двух антигенов с помощью иммуноцитохимии .J Histochem Cytochem 26: 322–324 [PubMed]
  • Цуруи Х, Нишимура Х, Хаттори С., Хиросе С., Окумура К., Шираи Т. (2000) Семицветная флуоресцентная визуализация образцов тканей на основе Фурье-спектроскопии и сингулярное разложение. J Histochem Cytochem 48: 653–662 [PubMed]
  • Valnes K, Brandtzaeg P (1984) Парное непрямое иммуноферментное окрашивание с первичными антителами того же вида. Применение пероксидазы хрена и щелочной фосфатазы в качестве последовательных меток.Histochem J 16: 477–487 [PubMed]
  • Van den Brink GR, Tytgat KM, Van der Hulst RW, Van der Loos CM, Einerhand AW, Büller HA, Dekker J (2000) H. pylori колокализируется с MUC5AC в желудке человека. Gut 46: 601–607 [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
  • van der Loos CM (1999) Методы множественного иммуноферментного окрашивания. Королевский справочник по микроскопии, № 45. Оксфорд, Великобритания, BIOS Scientific Publishers
  • van der Loos CM (2005) Множественное окрашивание в молекулярной морфологии.В Hacker GW, Tubbs RR, eds. Молекулярная морфология тканей человека: методы и приложения. Бока Ратон, Флорида, CRC Press, 27–63
  • van der Loos CM (2006) Применим ли набор для каталитической системной амплификации (CSA) II для срезов тканей криостата и двойного окрашивания? J Histotechnol 29: 157–162
  • van der Loos CM, Becker AE, van den Oord JJ (1993) Практические предложения для успешных экспериментов с иммуноферментным двойным окрашиванием. Histochem J 25: 1–13 [PubMed]
  • van der Loos CM, Das PK, van den Oord JJ, Houthoff HJ (1989) Методы множественного иммуноферментного окрашивания.Использование флуоресцеинированных, биотинилированных и немеченых моноклональных антител. J Immunol Methods 117: 45–52 [PubMed]
  • van der Loos CM, Göbel H (2000) Набор для исследований на животных (ARK) может использоваться в многоэтапном методе двойного окрашивания образцов тканей человека. J. Histochem Cytochem 48: 1431–1438 [PubMed]
  • van der Loos CM, van den Oord JJ, Das PK, Houthoff HJ (1988) Использование коммерчески доступных моноклональных антител для двойного иммуноферментного окрашивания.Histochem J 20: 409–413 [PubMed]
  • Vyberg M, Nielsen S (1998) Двухступенчатая система визуализации конъюгата с декстрановым полимером для иммуногистохимии. Appl Immunohistochemistry 6: 3–10
  • Weier HU, Weier JF, Renom MO, Zheng X, Colls P, Nureddin A, Pham CD, et al. (2005) Флуоресцентная гибридизация in situ и анализ спектральной визуализации человеческих ооцитов и первых полярных тел. J Histochem Cytochem 53: 269–272 [PubMed]
  • Wood GS, Warnke R (1981) Подавление эндогенной авидин-связывающей активности в тканях и ее значение для систем обнаружения биотин-авидин.J Histochem Cytochem 29: 1196–1204 [PubMed]

Виртуальное двойное окрашивание с Visiopharm

Виртуальное двойное окрашивание с Visiopharm — Простое, надежное и автоматизированное разделение
VirtualDoubleSading ™

Избегайте трудоемкого ручного выделения областей опухоли.

Загружая видео, вы соглашаетесь с политикой конфиденциальности Vimeo.
Узнать больше

Загрузить видео

Всегда разблокировать Vimeo

Улучшите результаты анализа изображений с помощью Visiopharm

Запросить демо
VirtualDoubleSading ™

VirtualDoubleStain ™ — это новый и запатентованный метод автоматизированного, надежного и поддающегося проверке разделения опухоли / стромы.Он может быть основан как на ручном обводке, так и на полностью автоматизированном количественном анализе изображений. Этот метод был разработан и утвержден в сотрудничестве с NordiQC и тщательно протестирован в практических клинических условиях в основных диагностических лабораториях по всей Европе.

Виртуальное тройное окрашивание
Слайд онкомаркера можно виртуально выровнять с двумя дополнительными слайдами, создавая сэндвич вокруг опухолевого маркера. Виртуальное тройное окрашивание позволяет анализировать еще больше биомаркеров, давая вам более полную картину микросреды опухоли.

Уверенность в своих клинических решениях

Важные клинические решения принимаются патологами на основе оценки биомаркеров. Хорошо известно, что существует значительная вариабельность внутри и между читателями, связанная с диагностическим считыванием и интерпретацией экспрессии биомаркеров. Существует острая необходимость уменьшить или устранить этот тип вариабельности для биомаркеров, которые будут использоваться в качестве прогностических и прогностических маркеров. Данные из тысяч образцов тканей подтверждают, что анализ изображений для обнаружения области опухоли в сочетании с количественной оценкой экспрессии биомаркеров обеспечивает значительное улучшение как воспроизводимости, так и точности.

Успех

Ваше сообщение успешно отправлено!

Предпочтение конфиденциальности

Visiopharm A / S использует файлы cookie, в том числе сторонние файлы cookie, для улучшения взаимодействия с пользователем на нашем веб-сайте за счет защиты функций, создания статистики и сохранения ваших предпочтений в маркетинговых целях.Если вы принимаете все, вы соглашаетесь на использование файлов cookie для этих целей.

  • Essential
  • Маркетинг
  • Внешние СМИ
Печенье

Visiopharm A / S использует файлы cookie, в том числе сторонние файлы cookie, для улучшения взаимодействия с пользователем на нашем веб-сайте за счет защиты функций, создания статистики и сохранения ваших предпочтений в маркетинговых целях.Нажимая «Принять все», вы соглашаетесь на использование файлов cookie для этих целей. Вы можете выбрать, какие категории файлов cookie вы хотите разрешить. Обратите внимание, что в зависимости от выбранных вами настроек некоторые функции на нашем веб-сайте могут быть вам недоступны.

Имя Borlabs Cookie
Провайдер Владелец этого сайта
Назначение Сохраняет предпочтения посетителей, выбранные в поле Cookie Borlabs Cookie.
Имя файла cookie borlabs-cookie
Срок действия cookie 1 год

при поддержке Borlabs Cookie

Политика конфиденциальности

Последовательное иммунофлуоресцентное окрашивание и анализ изображений для обнаружения большого количества антигенов в отдельных клеточных ядрах — Wählby — 2002 — Cytometry

В 1941 году Альберт Кунс выполнил первую успешную визуализацию антигена с помощью иммунофлуоресценции (1, 2).В течение многих лет единственным доступным флуорофором был флуоресцеина изотиоцианат (FITC). В 1957 году родамин был представлен в качестве альтернативной флуоресцентной метки (3). Введение узкополосных фильтров возбуждения и испускания означало, что FITC и родамин можно было изучать независимо на одном и том же образце, что позволило исследовать точные пространственные отношения между двумя антигенами (4).

Часто желательна одновременная визуализация трех или более антигенов с помощью иммунофлуоресценции.Однако многоцветное иммунофлуоресцентное окрашивание ограничено двумя факторами. Первый — это спектры флуорофоров, которые должны быть разделены полосовыми фильтрами для длин волн возбуждения и излучения. Если спектры флуорофоров перекрываются, что часто случается, когда много флуорофоров используются вместе, очень трудно различить сигналы, исходящие от разных флуорофоров. Второй фактор, ограничивающий многоцветное иммунофлуоресцентное окрашивание, — это наличие первичных антител различного происхождения.Большинство коммерчески доступных антител имеют кроличье или мышиное происхождение, что ограничивает количество возможных комбинаций первичных антител.

Было разработано несколько методов для преодоления нехватки первичных антител у разных видов. Первичные антитела можно конъюгировать непосредственно с флуорофорами, так что вторичные антитела, направленные против первичных антител определенного вида, больше не нужны. К сожалению, для успешного обнаружения большинства антигенов требуется усиление сигнала, которое достигается при использовании вторичного антитела, конъюгированного с флуорофором, а конъюгирование с флуорофором может изменить аффинность первичного антитела.Два первичных антитела одного и того же вида можно использовать, если используется один из различных методов блокирования с использованием Fab-фрагментов (5) или если первое вторичное антитело заменяется Fab-фрагментами, конъюгированными с флуорофором (6).

Совершенно другой подход, который иногда используется при иммуноокрашивании, — это элюирование первых примененных первичных и вторичных антител с использованием буфера с низким pH, оставляя только окрашенный конечный продукт (7). После элюирования можно провести еще один цикл окрашивания, используя второе первичное антитело того же вида, что и первое, вместе с другим окрашенным конечным продуктом.Однако флуорофоры не выдерживают элюции. Совсем недавно денатурация первичного антитела путем нагревания образца была успешно использована для уничтожения первого примененного первичного антитела (8). Опять же, используемый метод может применяться только к традиционному иммуноокрашиванию, но не к иммунофлуоресценции.

Мы разработали новый протокол последовательного иммунофлуоресцентного окрашивания (SIFS), основанный на комбинации элюции и денатурации как первичных, так и вторичных антител, а также флуорофоров.Процедура позволяет нам окрашивать один и тот же срез ткани не менее трех раз, что позволяет исследовать не менее шести антигенов в одном срезе ткани. Различные первичные антитела от одного и того же вида могут быть применены в разных раундах окрашивания, преодолевая ограниченную доступность первичных антител от разных видов без необходимости блокирования первого примененного первичного антитела. Интересные участки ткани фотографировали между каждым циклом окрашивания. Посредством цифровой регистрации изображений от каждого раунда окрашивания можно было создать изображение исследуемой области, которое содержало всю информацию о том, как был распределен каждый антиген.После полуавтоматической идентификации ядер отдельных клеток на полученных изображениях можно было определить интенсивность окрашивания каждого красителя в каждом ядре клетки в срезе ткани. На основании относительной интенсивности окрашивания каждую клетку автоматически классифицировали как положительную или отрицательную для каждого из исследованных антигенов. Морфологию ткани можно было визуализировать с помощью стандартного окрашивания HTX-эозином после завершения процедуры SIFS.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Подготовка ткани

Срезы тканей из обычно фиксированных и залитых в парафин образцов рака шейки матки или карциномы простаты были использованы для тестирования и оптимизации предложенного протокола.Срезы тканей вырезали толщиной 2–4 мкм. Тонкие срезы необходимы, чтобы свести к минимуму размытие изображения из-за множества слоев ячеек. Срезы инкубировали в течение ночи при 47 ° C для прилипания к предметным стеклам микроскопа SuperFrost Plus (Menzler Gläser, Брауншвейг, Германия). Срезы хранили при -20 ° C и перед окрашиванием ступенчато депарафинизировали в градуированных спиртах. Выделение антигена проводили путем варки в микроволновой печи в течение 2 × 5 мин в 0,1 М цитратном буфере, pH 6,0.

Для визуализации ядер клеток срезы тканей инкубировали в 10 мкМ растворе 4,6-диамидино-2-фенилиндола, дигидрохлорида (DAPI) в течение 5 мин.Срезы на короткое время промывали в буфере для промывки (0,05 мМ TRIS-HCl, pH 7,6, 0,3 мМ NaCl и 0,02% Tween 20) и помещали в монтажную среду DABCO (25 мг / мл 1,4-диазабицикло [2,2,2 ] октана и 0,1 × фосфатно-солевого буфера [PBS] в спектроглицерине, pH установлен на 8,6 с помощью HCl). Покровное стекло толщиной приблизительно 170 мкм (№ 1,5) использовалось для оптимизации оптических условий для 3D-микроскопии.

Районы для исследования были выбраны на основании морфологии DAPI. Они были сфотографированы в цифровом виде перед первым циклом окрашивания, что позволило отдельно измерить количество автофлуоресценции, испускаемой из образца для всех наборов фильтров.Использовались наборы фильтров, оптимизированные для обнаружения DAPI, FITC и Cy3 от Chroma Technology (Brattleboro, VT). Изображения были получены с использованием системы Delta Vision (Applied Precision, Сиэтл, Вашингтон) и оснащены охлаждаемой монохромной камерой CCD (Photometrics, Tucson, AZ). Использовали линзу Zeiss Plan-Neofluar 63 × / NA1.30 (Carl Zeiss GmbH, Оберкохен, Германия), что дало размер пикселя 0,1058 мкм и оптическое разрешение примерно 0,2 мкм в направлениях x и y. Для получения трехмерного изображения исследуемой территории семь z-сечений 0.Были получены изображения на расстоянии 5 мкм друг от друга, что дало окончательное разрешение трехмерного объема в направлении z 1,0 мкм. Первоначальный очаг был обнаружен при визуальном осмотре.

После того, как фон был задокументирован, слайды были осторожно демонтированы. Каждый раз, когда слайды снимали, их промывали в течение не менее 15 минут в промывочном буфере перед дальнейшей обработкой.

SIFS

Последовательное окрашивание срезов тканей проводили с использованием различных первичных антител.Для оптимизации протокола использовали мышиное моноклональное антитело (mAb) 6E6 против циклина A (Novocastra Laboratories, Ньюкасл-апон-Тайн, Соединенное Королевство) и кроличье поликлональное антитело sc-528, направленное против p27 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния). использовал. Кроме того, для перекрестных экспериментов использовали кроличьи поликлональные антитела H-432 против циклина A (Santa Cruz Biotechnology) и мышиные mAb K25020 против p27 (Transduction Laboratories, Lexington, KY). Все вторичные антитела были ослиного происхождения (Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA).Используемые вторичные антитела включали конъюгированные с FITC антитела против кролика, конъюгированные с Cy3 антимышиные антитела и конъюгированные с биотином антимышиные антитела. Вторичные антитела растворяли в блокирующем буфере с 4% ослиной сыворотки. Обнаружение биотина выполняли с использованием стрептавидина, конъюгированного с Cy3 (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, United Kingdom). Стрептавидин разбавляли PBS.

Для блокирования неспецифического связывания срезы ткани погружали в блокирующий буфер (1% бычий сывороточный альбумин [BSA] и 0.5% Твина 20 в PBS) в течение 30 мин. Затем применяли первичные антитела. Слайды закрывали покровными стеклами и оставляли на ночь при комнатной температуре во влажной камере. Срезы тканей промывали промывочным буфером 3 × 15 мин. Срезы тканей были погружены в блокирующий буфер второй раз на 30 мин, на этот раз с использованием блокирующего буфера с добавлением 4% ослиной сыворотки. Срезы тканей инкубировали со вторичными антителами в течение 30 мин, после чего следовали еще один цикл промывки в промывочном буфере 3 × 15 мин.Каждый раз, когда использовалось вторичное антитело, конъюгированное с биотином, слайды инкубировали с биотином-Cy3 в течение 30 минут и снова промывали, как описано выше. Наконец, слайды инкубировали с DAPI и устанавливали, как описано.

После фотографирования результата первого раунда окрашивания антитела утилизировали, используя элюцию, денатурацию или любую их комбинацию (см. Ниже). Элюирование ранее примененных вторичных и первичных антител выполняли, прежде всего, с использованием 0.1-М лизиновый буфер, pH 2,0 (7). Денатурацию нанесенных антител проводили точно так же, как антигенное восстановление; слайды готовили в цитратном буфере в микроволновой печи (8).

После денатурации и / или элюирования красителя интересующие области снова фотографировали, чтобы проверить оставшиеся уровни ранее нанесенных антител и флуорофоров. Чтобы измерить количество оставшихся флуорофоров, визуализацию выполняли просто без дополнительной обработки.Для измерения как оставшихся первичных антител, так и оставшихся флуорофоров срез ткани снова погружали в блокирующий буфер с 4% ослиной сыворотки, инкубировали с тем же вторичным антителом, которое использовалось ранее, и снова промывали, как описано выше. Любые оставшиеся первичные антитела затем вызовут флуоресценцию, привлекая вновь нанесенные вторичные антитела, и, таким образом, будут обнаружены.

Последующие циклы окрашивания или удаления пятен выполнялись таким же образом, как описано выше для первого цикла окрашивания.Каждый цикл окрашивания или удаления пятен приводил к получению одного объема изображения для каждого из использованных (или недавно удаленных) флуорофоров и одного объема для окрашивания DAPI. DAPI использовался в качестве эталонного красителя при анализе изображений, и поэтому его приходилось повторно применять в каждом цикле окрашивания, поскольку процедура удаления пятен также удаляла пятно DAPI. Таким образом, фоновая флуоресценция перед первым окрашиванием, а также любые оставшиеся флуорофоры или первичные антитела после каждого удаления пятен документировались вместе с результатами окрашивания.Окрашивая предметные стекла на гематоксилин-эозин после процедуры последовательного иммуноокрашивания, можно было исследовать морфологию исследуемой ткани.

Анализ изображений

Для количественной оценки флуоресценции, испускаемой каждым исследуемым ядром на каждом этапе процесса окрашивания, полученные объемы анализировали с использованием методов анализа изображений, описанных ранее (9). Экспрессия, выходящая за пределы ядра, может быть проанализирована путем сегментации цитоплазмы.Однако в данном исследовании это не исследовалось. Таким образом, методы анализа изображений можно разделить на четыре этапа: регистрация изображения, сегментация 2D и 3D изображения, извлечение данных изображения и анализ данных.

Регистрация изображения

После каждого цикла окрашивания или удаления пятен слайды помещали в микроскоп и фотографировали. Одно монохромное изображение с каждым из наборов фильтров для обнаружения DAPI, FITC и Cy3 было получено перед перемещением фокальной плоскости в следующую позицию по оси Z.Это повторяли семь раз, пока не был создан один объем воксельного изображения 1024 × 1024 × 7 для каждой из исследованных длин волн. Каждый раз, когда слайды повторно вставляли в микроскоп, их положение изменялось с помощью системы автоматического изменения положения системы DeltaVision. Репозиционирование не было идеальным, и трансляция в направлениях x, y и z, а также вращение по оси z между последующими наборами изображений остались. Как правило, между последующими наборами изображений появлялось перемещение на 5–10 пикселей в направлении x и y, перемещение на 1 пиксель в направлении z и поворот на 1–2 ° по оси z.Точное изменение положения или совмещение изображений было необходимо для автоматических шагов дальнейшего анализа на основе отдельных ячеек.

Поскольку каждый набор изображений содержал изображение DAPI, а морфология DAPI не изменялась между последующими раундами окрашивания или удаления пятен, изображения DAPI использовались для регистрации всего набора изображений. Изображение DAPI каждого набора изображений было автоматически зарегистрировано в изображении DAPI первого набора изображений с использованием сопоставления уровней серого в 3D (9).В направлении z использовался меньший размер шага итерации, чем в направлении x и y, из-за плоской формы объемов изображения (1024 × 1024 × 7 пикселей) и меньшей ошибки перевода в направлении z. Затем матрица преобразования наилучшего совмещения была применена к изображениям FITC и Cy3 в том же наборе.

Сегментация 2D и 3D изображений

После регистрации всех объемов изображения ядра клеток необходимо было идентифицировать путем сегментации, чтобы можно было выделить сигнал флуоресценции.Перед сегментацией было создано общее трехмерное эталонное изображение из всех зарегистрированных DAPI-изображений ядер клеток. Для каждого вокселя выбиралась максимальная интенсивность всех зарегистрированных изображений относительно глобальной системы координат. Таким образом, для каждого эксперимента нужно было сегментировать только эталонное изображение. Другими словами, для эксперимента с тремя последовательными тройными окрашиваниями, в результате которого было получено 18 объемов изображений, нужно было сегментировать только одно изображение.

Метод, вдохновленный алгоритмом водораздела (10, 11), был использован для разделения кластеров ячеек и сегментации изображения на ячейки и фон за один шаг, как подробно описано (9).Первоначальная сегментация с использованием этого метода всегда выполнялась на 2D-проекции максимальной интенсивности вдоль оси z эталонного изображения. Эта полностью автоматическая начальная сегментация приводит как к избыточной, так и к недостаточной сегментации в областях тесно сгруппированных ядер. Ошибки исправлялись вручную с помощью инструмента цифрового редактирования, что делало этап сегментации полуавтоматическим. Ручная коррекция является второстепенной частью полностью автоматического процесса, потому что для полного анализа каждого полного последовательного эксперимента с окрашиванием требуется только одно двухмерное сегментирование.Расширение до 3D было создано путем установления порогового значения на уровне серого для обычного 3D-объема на том же уровне, который использовался для порогового значения для фона в 2D-сегментации. Двухмерные метки были автоматически перенесены в трехмерный объем путем расширения двухмерной сегментации на «трехмерные цилиндры» в z-направлении и выполнения логического И между помеченными трехмерными цилиндрами и трехмерным изображением с пороговым значением, сохраняя подписи двухмерной сегментации.

Извлечение данных изображения

На этапе регистрации была получена матрица преобразования для каждого набора изображений, а на этапе сегментации был получен общий шаблон сегментации, который можно было использовать для всех изображений после преобразования в соответствии с матрицей преобразования.Для извлечения данных изображения матрица преобразования каждого набора изображений применялась ко всем изображениям в наборе. После этого интенсивности вокселей были интегрированы по каждому ядру клетки, определенному с помощью шаблона 3D-сегментации. Поскольку шаблоны сегментации были созданы из DAPI-изображений ядер клеток, они обнаружили правильное положение ядер клеток в срезах ткани независимо от сигнала флуоресценции от других красителей.

Анализ данных

Можно ожидать линейной зависимости между концентрацией флуорофора и излучаемым светом (12, 13).Отклик камеры также линейный (14). Поэтому можно ожидать, что интенсивность детектируемого сигнала прямо пропорциональна количеству флуорофора, присутствующего в образце. Однако многие переменные влияют на интенсивность окрашивания среза ткани. Вариации фиксации и толщины ткани, депарафинизации, восстановления антигена, температуры и времени на этапах окрашивания и промывки, а также времени воздействия влияют на окончательный обнаруженный сигнал. Различия между разными тканевыми срезами затрудняют количественное сравнение клеток из разных тканевых срезов.Можно сравнить интенсивности окрашивания клеток в одном и том же срезе ткани. Чтобы провести сравнение ячеек на разных слайдах, необходимо классифицировать их в соответствии с их значениями интенсивности относительно других ячеек на том же слайде. Нами разработан алгоритм расчета пороговых значений для объективной классификации ядра клетки как окрашивающего положительного или отрицательного на определенный антиген (15). Выбор порога основан на форме гистограммы интенсивности окрашивания.Этот метод был развит Линдбладом (16), и для аппроксимации распределений использовалась оценка плотности ядра. На основе пороговых значений, задаваемых максимумами второй производной оценки плотности ядра, для каждой ячейки было найдено значение принадлежности к нечеткому классу (17). Клетки были классифицированы как строго отрицательные, отрицательные, нейтральные, положительные или строго положительные.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Во время разработки описанного протокола для SIFS рутинно фиксированного и залитого парафином материала была проведена серия экспериментов.Параметры элюции и денатурации были скорректированы для оптимизации удаления ранее нанесенных антител без нарушения антигенности срезов ткани. Уровень успеха оценивался с использованием описанных методик анализа изображений. Все эксперименты проводились два или более раз для обеспечения воспроизводимости.

Элюция для удаления примененных первичных и вторичных антител

Чтобы изучить, достаточно ли элюирования с использованием глицинового буфера для удаления всех ранее примененных антител, а также флуорофоров, конъюгированных со вторичными антителами, без нарушения антигена, слайды промывали глициновым буфером, pH 2.0, на 0, 0,5, 1, 1,5, 2 и 3 ч. Результаты показаны на рисунке 1. Через 1-2 часа большая часть ранее нанесенных флуорофоров была удалена. Однако при повторном нанесении вторичного антитела ранее сильно окрашенные ядра все еще испускали слабую флуоресценцию даже после 3 часов элюции. Это указывало на то, что часть первичных антител оставалась связанной со своими антигенами.

Удаление пятен элюированием. Интенсивность окрашивания подмножества репрезентативных положительных клеток (обнаруженная при осмотре слайдов после первого этапа окрашивания) из шести слайдов изучалась перед окрашиванием (но с добавлением вторичных антител), после нанесения первого окрашивания, после элюирования для 0, 0.Через 5, 1, 1,5, 2 или 3 часа после добавления нового FITC-конъюгированного вторичного антитела и после применения нового первичного и FITC-конъюгированного вторичного антитела. Через 1,5 часа большая часть ранее примененных первичных и вторичных антител была удалена. Однако при повторном нанесении вторичного антитела, конъюгированного с FITC, ранее сильно окрашенные ядра все еще испускали слабую флуоресценцию. Это указывало на то, что небольшая часть первичных антител оставалась связанной со своими антигенами даже после 3 часов элюции.Антигены не были разрушены обработкой, и интенсивность окрашивания увеличилась для второго цикла окрашивания, что указывает на то, что антигены становятся более доступными для антител после элюирования. Очень высокая интенсивность окрашивания появлялась, если элюирование длилось менее 1 ч, вероятно, из-за образования комплексов первичных и вторичных антител.

Первичные антигены (циклин A и p27) не разрушались при элюировании, и интенсивность окрашивания фактически увеличивалась во втором цикле окрашивания, что указывает на то, что антигены могут быть более доступны после элюирования.Была отмечена очень высокая интенсивность окрашивания после второго цикла окрашивания, если время элюирования было короче 1 часа, вероятно, из-за оставшихся вторичных антител, связывающих впоследствии примененные первичные антитела. Элюция полностью не удаляла нанесенные комплексы биотин-стрептавидин-Cy3. Большие агрегаты стрептавидина-Cy3 оставались даже после 6 ч элюции (данные не показаны).

Денатурация может разрушить оставшиеся антитела

Поскольку элюция не удаляла все первичные антитела, была предпринята попытка уничтожить оставшиеся антитела посредством тепловой денатурации.Окрашенные слайды, подвергшиеся элюции в течение 2 ч, денатурировали в течение 0, 5, 2 × 5 или 3 × 5 мин. Как описано ранее, 2 × 5 мин было достаточным временем для денатурирования всех первичных антител (8; рис. 2).

Удаление пятен денатурацией. Поскольку элюция не удаляла все первичные антитела, была предпринята попытка денатурировать оставшиеся антитела. Интенсивность окрашивания подмножества репрезентативных положительных клеток (обнаруженных при осмотре слайдов после первого этапа окрашивания) из пяти слайдов изучали до окрашивания, после нанесения первого красителя, после элюирования в течение 2 часов с последующей денатурацией на 0,5 , 2 × 5 или 3 × 5 мин после добавления нового FITC-конъюгированного вторичного антитела и после применения нового первичного и FITC-конъюгированного вторичного антитела.Когда за 2-часовой элюцией следовала денатурация в течение 2 × 5 мин, все первичные антитела удалялись или разрушались.

Денатурация сама по себе или с последующей элюцией не может удалить флуорофоры

Эффективность одной денатурации или денатурации с последующей более короткой элюцией была проверена, чтобы увидеть, будет ли она одинаково эффективна при удалении первичных и вторичных антител при 2-часовой элюции с последующей денатурацией 2 × 5 мин.Сама по себе денатурация не смогла полностью удалить флуорофоры (данные не показаны), а также, по-видимому, значительно снизила эффективность последующей элюции (данные не показаны).

Эксперименты с кроссовером

Перекрестный эксперимент был разработан для проверки того, полностью ли смывается пятно, не влияя на антигенность, а также для проверки того, будет ли та же клетка классифицирована как положительная / промежуточная / отрицательная при повторном применении того же красителя.Один перекрестный эксперимент, состоящий из трех раундов окрашивания, показан на фиг. 3. На протяжении всего эксперимента окрашивали только два антигена (циклин А и р27), но для каждого антигена использовали два разных первичных антитела. Одно из антител было мышиного происхождения, а другое — кроличьего. После удаления каждого пятна заменяли антитело, используемое для обнаружения каждого из антигенов. Таким образом, вторичное антитело, несущее флуорофор (FITC или Cy3), смещалось между антигенами после каждой стадии окрашивания.Эта установка дает априорную информацию об ожидаемом результате второго и третьего раундов окрашивания, потому что результат должен быть таким же, как после первого раунда окрашивания, но в противоположном канале флуорофора. Меченое вторичное антитело наносили повторно после каждого удаления пятен для визуализации оставшегося первичного антитела. Таким образом, можно было измерить удаление ранее примененных антител. Эксперимент предоставил нам метод, показывающий, что антигенность исследуемых антигенов не была нарушена элюцией или денатурацией и что антитела и флуорофоры можно было удовлетворительно удалить после каждого из двух первых циклов окрашивания.

Установка кроссоверного эксперимента. На каждом этапе окрашивания или промывки (горизонтальные ряды) ткань окрашивали DAPI и наносили вторичные антитела FITCαrabbit и Cy3αmouse. Первичные антитела исключались после каждого этапа удаления пятен и заменялись перед следующим циклом окрашивания. Все изображения являются проекциями 3D-изображений (с объяснением размытости). Они были получены с использованием одного и того же времени экспозиции, а затем были масштабированы с использованием того же интервала уровней серого.Выравнивания гистограммы или другого улучшения изображения (которое улучшило бы качество печати) избегали, чтобы визуализировать истинное изменение сигнала флуоресценции. Отображается только небольшая часть полного набора зарегистрированных изображений.

Любая остаточная флуоресценция от предыдущих этапов окрашивания регистрировалась путем визуализации образца после каждого удаления пятен. Время экспозиции оставалось постоянным на протяжении всего эксперимента для всех изображений, полученных с одним и тем же набором фильтров.Автофлуоресценция, а также остаточная флуоресценция, остающаяся после этапа удаления пятен, могут быть удалены с последующего этапа окрашивания простым пиксельным вычитанием. Относительная концентрация антигена на клетку была аппроксимирована как средняя интенсивность пикселей под шаблоном трехмерной сегментации, как описано выше. Затем каждая ячейка была классифицирована как положительная (зеленая), слабо положительная (голубая), нейтральная (синяя), слабо отрицательная (пурпурная) или отрицательная (красная) с использованием описанных методов классификации. Результаты классификации показаны на рисунке 4 вместе с изображениями окрашенных клеток (после вычитания соответствующих остаточных изображений).Изображения были масштабированы для оптимальной визуализации уровней серого. Как показано на рисунке 4, клетки классифицируются одинаково после каждого из трех циклов окрашивания на циклин A (с двумя незначительными изменениями от нейтрального до слабо положительного). Это показывает, что антигенность сохраняется после последующих этапов окрашивания и что на классификацию не влияют предыдущие этапы окрашивания. Различия в результатах классификации больше, когда речь идет о пятне p27. Результаты аналогичны после первого и третьего этапов окрашивания, когда использовали кроличьи поликлональные первичные антитела, по сравнению со вторым этапом окрашивания, когда использовали мышиное моноклональное первичное антитело.Наиболее вероятное объяснение — различия в специфичности используемых первичных антител.

Результаты процедур анализа и классификации изображений. Каждая ячейка была классифицирована как положительная (зеленая), слабо положительная (голубая), нейтральная (синяя), слабо отрицательная (пурпурная) или отрицательная (красная) с использованием методов классификации, описанных в материалах и методах. Обратите внимание, как окрашивание циклином А приводит к почти одинаковой классификации клеток после каждого из этапов окрашивания.Различия в классификации больше для красителя p27, но это можно объяснить различиями в реактивности используемых первичных антител, поскольку первый и третий раунды окрашивания были почти идентичными.

Вывод описанного перекрестного эксперимента состоит в том, что ранее нанесенные пятна можно удалить по крайней мере дважды и что по крайней мере два раунда удаления пятен могут быть выполнены без обязательной потери антигенности исследуемых антигенов.Это открывает возможность окрашивать один срез ткани по крайней мере на шесть различных антигенов, используя два первичных антитела различного видового происхождения на каждом этапе окрашивания.

Некоторые антигены теряют антигенность во время элюирования

Представленные выше результаты были получены с использованием антител, направленных против циклина А и р27, поскольку эти белки расположены в основном в ядре клетки и поскольку клетки обычно содержат либо циклин А, либо р27, но не оба, что упростило проверку метода.Другие антитела также были протестированы, чтобы увидеть, могут ли 2-часовая элюция и 2 × 5-минутная тепловая денатурация воздействовать на них и их антигены аналогичным образом. Среди протестированных антител можно выделить два совершенно разных паттерна (фиг. 5), которые проиллюстрированы антителом к ​​р53 FL-393 (Santa Cruz Biotechnology) и антителом к ​​р21 EA10 (Oncogen Research Products, Дармштадт, Германия). Антитело, обнаруживающее р53, было удалено или разрушено в достаточной степени обработкой, и во втором раунде окрашивания оно окрашивалось даже сильнее, чем в первом, точно так же, как ранее описанные антитела против циклина А и р27.Другие антитела, демонстрирующие такое же поведение, включали другое антитело, направленное против p53 (DO1, Santa Cruz Biotechnology), антитело против MDM2 (SMP14, Santa Cruz Biotechnology), антитело против циклина E (HE12, Santa Cruz Biotechnology) и антитело, направленное против p57 (C-20, Santa Cruz Biotechnology). С другой стороны, антитело EA10 против p21 вообще не окрашивалось во втором цикле, что указывает на то, что обнаруживаемый им эпитоп на p21 был разрушен элюцией. Таким образом, 9 из 10 протестированных антител (пять из шести протестированных антигенов) можно использовать во втором или более позднем цикле окрашивания, тогда как антитело, обнаруживающее p21, необходимо использовать в первом цикле окрашивания.

Две разные реакции на элюцию и денатурацию. Антитело FL393 против p53 хорошо удаляется элюированием в течение 2 часов и денатурацией 2 × 5 минут, и p53 сохраняет свою антигенность. Аналогичным образом реагировало большинство протестированных антител и антигенов. p21 отреагировал совершенно иначе. Из-за элюции он потерял всю свою антигенность. Это единственный антиген, который проявляет такое поведение. Каждый набор из трех изображений был получен с использованием одинакового времени экспозиции.Изображения обрабатывались точно так же в отношении настроек контрастности и яркости.

ОБСУЖДЕНИЕ

Представленные результаты показывают, что первичные и вторичные антитела, а также флуорофоры могут быть удалены из обычно фиксированного и залитого парафином среза ткани. Процедура основана на элюировании антител и флуорофоров с последующей денатурацией всех оставшихся первичных антител. Таким образом, срез ткани можно многократно окрашивать, что позволяет обнаруживать большое количество антигенов.Наш метод количественной оценки концентрации антигена начинается с полностью автоматической регистрации изображений и создания эталонного изображения с последующей полуавтоматической 2D сегментацией. Двухмерная сегментация расширяется до трехмерной, и, наконец, данные изображения извлекаются и анализируются.

Представленная методика SIFS требует полного удаления ранее нанесенных флуорофоров и антител без нарушения антигенности образца. Мы использовали элюцию и денатурацию, но, вероятно, существуют другие средства для достижения таких же или лучших результатов.Представленный протокол позволяет полностью удалить флуорофоры и антитела, когда для оценки результатов используется только визуальный осмотр. Иногда остается обнаружить достаточное количество первичных антител при использовании высокочувствительной камеры CCD. Слабый сигнал, исходящий от оставшихся флуорофоров и антител, можно вычесть из следующего цикла окрашивания с использованием описанных методов анализа изображений и экспериментальной установки. Еще один небольшой недостаток предложенного протокола заключается в том, что элюирование имеет тенденцию к увеличению ядерной фоновой флуоресценции.

Элюция и денатурация повышают антигенность ткани для большинства протестированных антигенов. Второй цикл окрашивания обычно сильнее первого, и представленные эксперименты (рис. 1, 2) показывают, что это не артефакт из-за оставшихся первичных и вторичных антител после первого цикла окрашивания. Наиболее вероятная причина этого явления заключается в том, что элюция и денатурация фактически улучшают антигенность ткани за счет улучшения ранее выполненного восстановления антигена.Антигенное восстановление, выполняемое в течение 3 или 4 × 5 мин вместо стандартных 2 × 5 мин, иногда дает более сильное окрашивание (данные не показаны).

При разработке представленной методики была замечена высокая вариабельность интенсивности окрашивания в разных тканях, а также в материале, фиксируемом по-разному. Возможно, что описанный протокол необходимо адаптировать для работы с материалом из других тканей, кроме рака шейки матки, и с материалом, который разделен и закреплен по-разному.Однако представленный протокол успешно использовался как минимум для двух раундов окрашивания даже на клетках, выращенных в однослойной культуре и зафиксированных в течение 1 часа в 10% формалине (Hanna-Stina Martinsson, личное сообщение).

Перед разработкой полного эксперимента SIFS необходимо тщательно протестировать антитела и их антигены, чтобы оценить их реакцию на элюцию и денатурацию. Мы видели два типа реакций. Большинство антител легко удаляются, а их антигены сохраняют свою антигенность (см. P53 на рис.5). Второй тип реакции иллюстрируется p21 (рис. 5). Первичное антитело легко удаляется, но элюция разрушает антигенность p21. Антигены, проявляющие такое поведение, могут быть окрашены только в первом цикле окрашивания. Первичные или вторичные антитела, которые не удаляются при элюировании, представляют собой возможный третий тип реакции на элюцию и денатурацию. Эти антитела можно применять только в последнем раунде окрашивания. Количество оставшегося первичного антитела, которое можно принять, т.е.е. различие между первым и третьим типами реакции может варьироваться в зависимости от системы обнаружения флуоресценции и наличия инструментов анализа изображений для удаления любого остаточного сигнала из последующих изображений.

Каждое новое вторичное антитело и каждый новый флуорофор также требуют тестирования перед использованием. Для обеспечения оптимальных результатов может потребоваться оптимизация pH и продолжительности элюирования, температуры и продолжительности денатурации, а также порядка окрашивания для каждого отдельного эксперимента SIFS.

Было представлено несколько альтернативных методов удаления или уничтожения первичных антител и / или вторичных антител, конъюгированных с флуорофором. Элюирование было выполнено с различной степенью успеха с использованием глицинового буфера (7), диметилформамида (18), глицина и диметилформамида в сочетании с электрофорезом (19), KMnO 4 -H 2 SO 4 (20) и HCl (21). Более короткая денатурация при более высокой температуре (130 ° C) может быть очень эффективной, если ткань должным образом защищена путем погружения в глицерин на 5-7 дней (22).Кроме того, денатурация может выполняться обработкой парами формальдегида вместо нагревания (23). Эти методы должны быть оценены по отдельности и в сочетании, чтобы найти наилучший способ удаления пятен иммунофлуоресценции.

Анализ полученных изображений был проведен с целью устранения предвзятости наблюдателя и получения большего количества количественных данных из проведенных экспериментов. Все шаги полностью автоматические, за исключением ручного исправления ошибок сегментации.Поскольку все изображения эксперимента зарегистрированы в общем эталонном изображении, сегментация выполняется только в одном изображении для полного эксперимента. Трехмерное расширение двухмерной сегментации приводит к небольшим ошибкам при наложении ячеек. В настоящее время рассматривается более совершенный алгоритм сегментации для 3D и инструменты коррекции для 3D-сегментации.

Это исследование было сосредоточено на анализе антигенов, находящихся в ядре клетки. Окрашивая цитоплазму (и / или клеточную мембрану) и сегментируя изображения на основе этого окрашивания, антигены, расположенные в цитоплазме, можно исследовать на уровне отдельных клеток.Методы сегментации цитоплазмы в настоящее время находятся в стадии разработки.

Будущее развитие SIFS, безусловно, приведет к появлению более совершенных протоколов удаления пятен, а также к оборудованию, обеспечивающему высокоавтоматизированное получение изображений, удаление пятен и окрашивание. Более высокая степень воспроизводимости, достигаемая за счет автоматизации процесса, будет большим преимуществом и может даже позволить количественные измерения уровней исследуемых антигенов. Вероятно, будет разработано специализированное программное обеспечение, позволяющее лучше представить полученные данные, что упростит анализ.Наше видение — это система, которая автоматически выполняет несколько раундов SIFS с последующим классическим окрашиванием HTX-эозином. Данные будут представлены в виде изображения HTX-эозина с добавлением синтетических цветов, чтобы показать относительные или, возможно, даже абсолютные уровни исследуемых антигенов в каждой клетке. С такой системой было бы легко оценить распределение очень большого количества антигенов по отношению друг к другу и к морфологии ткани. Состояние сложных путей, таких как ARF-p53-MDM2-p21-CDK2-pRB-E2F или сигнальных каскадов, затем можно было бы изучить на уровне отдельных клеток в срезах ткани или на тканевых микромассивах.

Благодарности

Представленная работа была поддержана Шведским фондом стратегических исследований (SFF) через программу визуальных информационных технологий (VISIT), грантами от Шведского онкологического общества и Cancerföreningen в Стокгольме Андерсу Зеттербергу, а также грантами Svenska Läkaresällskapet и Karolinska. Институт.

    Методы иммунофлуоресцентного окрашивания

    Методы иммунофлуоресцентного окрашивания

    Магазин не будет работать корректно, если куки отключены.

    Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript. Для наилучшего взаимодействия с нашим сайтом обязательно включите Javascript в своем браузере.

    • Дом
    • Методы иммунофлуоресцентного окрашивания


    Методы иммунофлуоресцентного окрашивания также можно успешно использовать для мечения нескольких антигенов в одном препарате.Эти методы особенно полезны для совместной локализации антигенов в одном и том же компартменте клетки и в этом отношении имеют явное преимущество перед системами обнаружения на основе ферментов.

    Традиционно двойное флуоресцентное мечение достигается с помощью флуоресцентно конъюгированных вторичных антител против первичных антител разных видов. Хотя этот метод в целом имеет тенденцию быть менее чувствительным, чем ферментативное окрашивание, чувствительность флуоресцентного красителя можно повысить, используя (стрепт) систему авидин-биотин для амплификации метки.Многие принципы, касающиеся мечения множественных антигенов, применимы как к иммунофлуоресцентным, так и к ферментативным методам (см. Раздел «Иммуноферментные методы окрашивания»). Для достижения наилучших результатов рекомендуется последовательное окрашивание каждого первичного антитела. Как и в случае применения ферментов, порядок маркировки, соответствующие контроли и дополнительные этапы блокирования могут быть важны для получения оптимальных результатов. В отличие от ферментативного окрашивания, особое внимание следует уделять виду используемых первичных антител.Для флуоресцентных применений два первичных антитела обычно должны быть от разных видов, в противном случае может возникнуть артефактное совместное окрашивание антигенов. Однако использование двух первичных антител мыши является исключением. См. Раздел «Множественное иммунофлуоресцентное маркирование с использованием двух или более мышиных моноклональных первичных антител».

    Кроме того, если система (стрепт) авидин-биотин используется для визуализации обоих антигенов, ДОЛЖЕН использоваться блок (стрепт) авидин-биотин перед вторым этапом первичного антитела.

    После маркировки важно сохранить интенсивность флуоресцентного сигнала, поскольку некоторые флуоресцентные продукты склонны к быстрому выцветанию при просмотре под микроскопом. В большинстве случаев это легко достигается путем нанесения на препарат покровного стекла, предотвращающего выцветание и фотообесцвечивания, такого как монтажная среда VECTASHIELD®. Использование VECTASHIELD® также позволяет хранить препарат в течение длительного времени без значительной потери интенсивности.

    Автофлуоресценция ткани может скрывать окрашивание в зависимости от типа ткани, метода фиксации и фильтра микроскопа, используемого для визуализации.Это следует оценить перед окрашиванием и, при необходимости, подавить автофлуоресценцию, используя соответствующие методы.

    Следующие протоколы предназначены для замороженных срезов тканей. Эти протоколы могут быть адаптированы для других препаратов ткани.

    Толстая кишка (замороженная) — двойная этикетка
    • Мульти-цитокератин (m), набор флуоресцеина M.O.M.TM (зеленый). TM®
    • Desmin (m), M.O.M. Базовый комплект, Texas Red Avidin DCS (красный).

    Миндалины (замороженные) — Двойная этикетка
    • Ki67 (m), M.O.M.TM Fluorescein Kit (зеленый).
    • Пан-цитокератин (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).

    Тонкий кишечник (замороженный) — двойная этикетка
    • PGP9,5 (м), базовый набор M.O.M.TM, стандартный набор VECTASTAIN® ABC-AP, субстрат Vector® Red AP (красный).
    • Desmin (m), набор M.O.M.TM Fluorescein Kit (зеленый).

    Протокол

    : Двойное иммунофлуоресцентное маркирование с использованием двух первичных антител от разных видов

    Окрашивание на первый антиген

    1. Подготовка тканей. Зафиксируйте срезы подходящим фиксатором для исследуемого антигена (см. Примечание 1).
    2. Воздушно-сухие секции.
    3. Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере (PBS).
    4. Этап блокировки авидина / биотина. При необходимости выполните блокировку авидина / биотина (набор для блокирования авидина / биотина, № по каталогу SP-2001). Инкубируйте секции с раствором авидина в течение 15 минут. Кратко промойте буфером, затем инкубируйте в растворе биотина в течение 15 минут. Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере.Этот этап блокировки можно исключить, если соответствующие средства управления определили, что этот этап не нужен.
    5. Этап блокировки белка. Инкубируйте срезы в течение 20 минут с буфером, содержащим 5% нормальную блокирующую сыворотку (NS), которая была приготовлена ​​из видов, у которых получены вторичные антитела.
    6. Удалите лишнюю сыворотку из срезов.
    7. Первичное антитело. Инкубируйте срезы с первым первичным антителом, разведенным в соответствующем разбавителе антител (буфер, содержащий 5% NS), используя подходящую концентрацию и продолжительность инкубации.
    8. Промыть 5 минут в буфере.
    9. Вторичное антитело. Инкубируйте срезы в течение 30 минут с биотинилированным вторичным антителом (5-10 мкг / мл, разведенным в буфере, содержащем 5% NS).
    10. Промойте слайды в буфере в течение 5 минут.
    11. Конъюгат авидина. Инкубируйте срезы с флуоресцеином авидином DCS (15-20 мкг / мл, разведенным в буфере) в течение 5-10 минут.
    12. Промойте слайды в буфере в течение 5 минут.

      Окрашивание второго антигена

    13. Этап блокировки авидина / биотина. Примените блок авидина / биотина в соответствии с этапом 4. (Этот этап необходимо выполнить, чтобы предотвратить взаимодействие второго набора реагентов для маркировки с первым набором реагентов для маркировки).
    14. Этап блокировки белка. Инкубируйте секции в течение 20 минут с 5% NS.
    15. Удалите лишнюю сыворотку из срезов.
    16. Первичное антитело. Инкубируйте срезы со вторым первичным антителом, разведенным в соответствующем разбавителе антител (буфер, содержащий 5% NS), используя подходящую концентрацию и продолжительность инкубации.
    17. Промойте слайды в буфере в течение 5 минут.
    18. Вторичное антитело. Инкубируйте срезы в течение 30 минут с биотинилированным вторичным антителом (5-10 мкг / мл, разведенным в буфере, содержащем 5% NS).
    19. Промойте слайды в буфере в течение 5 минут.
    20. Авидин конъюгат. Инкубируйте срезы с Texas Red® Avidin DCS (15-20 мкг / мл, разведенный в буфере) в течение 5-10 минут.
    21. Промойте слайды в буфере в течение 5 минут.
    22. Установите с помощью подходящего монтажного материала VECTASHIELD®.
    23. Наблюдать под флуоресцентным микроскопом.

    ПРИМЕЧАНИЯ:
    1. Ткани, фиксированные альдегидом (например, формалин), имеют тенденцию быть автофлуоресцентными и могут затруднять интерпретацию специфического сигнала флуоресцеина.

    Множественное иммунофлуоресцентное мечение с использованием двух или более мышиных моноклональных первичных антител

    Специфическая локализация мышиных первичных антител на ткани мыши была проблематичной до введения нашей мыши Vector® Mouse (M.O.M.TM) Наборы для иммунодетекции.

    Эти наборы M.O.M.TM блокируют эндогенные иммуноглобулины мыши в ткани мыши, обеспечивая точное распознавание первичного антитела мыши биотинилированным вторичным антителом против IgG мыши, устраняя запутанный фон.

    Используя ту же технологию блокирования мышиного Ig, можно флуоресцентно детектировать несколько первичных антител мыши на одном и том же срезе ткани, независимо от того, имеет ли ткань мышиное происхождение.

    Миндалины (замороженные) — Двойная этикетка
    • Ki67 (м), M.Набор флуоресцеина O.M.TM (зеленый).
    • CD20 (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).

    Номер M.O.MTM. Набор: Кишечник мыши (замороженный) — двойная этикетка
    • Периферин (m), биотинилированный лошадиный антимышиный IgG, флуоресцеин авидин DCS (зеленый).
    • Десмин (m), биотинилированный лошадиный антимышиный IgG, Texas Red® Avidin DCS (красный).
    ПРИМЕЧАНИЕ СМЕШИВАНИЕ ФОНА И СИГНАЛОВ.

    С набором M.O.M.TM: кишечник мыши (замороженный) — двойная этикетка
    • Периферин (m), набор M.O.M.TM флуоресцеина (зеленый).
    • Desmin (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный). СРАВНИТЬ С ФОТОГРАФИЕЙ НАБОР NO M.O.M.TM.

    Набор M.O.M.TM: толстая кишка (замороженный) — двойная этикетка
    • Мультицитокератин (m), биотинилированный лошадиный антимышиный IgG, флуоресцеин авидин DCS (зеленый).
    • Десмин (m), биотинилированный лошадиный антимышиный IgG, Texas Red® Avidin DCS (красный).
    ПРИМЕЧАНИЕ СМЕШИВАНИЕ ФОНА И СИГНАЛОВ.

    С набором M.O.M.TM: толстая кишка (замороженная) — двойная этикетка
    • Мульти-цитокератин (m), M.O.Набор M.TM Fluorescein Kit (зеленый).
    • Desmin (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный). СРАВНИТЬ С ФОТО

    НАБОРА ADJACENT NO M.O.M.TM

    Протокол: множественное иммунофлуоресцентное мечение с использованием двух или более мышиных моноклональных первичных антител

    Окрашивание на первый антиген

    1. Подготовка тканей. Зафиксируйте срезы подходящим фиксатором для исследуемого антигена (см. Примечание 1).
    2. Воздушно-сухие секции.

    3. Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере (PBS).
    4. Этап блокировки авидина / биотина. Выполнить

    Блокирование авидина / биотина, если необходимо (набор для блокирования авидина / биотина, № по каталогу SP-2001). Инкубируйте секции с раствором авидина в течение 15 минут. Кратко промойте буфером, затем инкубируйте в растворе биотина в течение 15 минут. Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере. Этот этап блокировки можно исключить, если соответствующие средства управления определили, что этот этап не нужен.

    1. Этап блокировки мышиного Ig. Инкубируйте срезы в течение 1 часа в рабочем растворе M.O.M.TM реагент для блокировки Ig мыши (см. Примечание 2).
    2. Промойте секции 2 раза по 2 минуты в буфере (см. Примечание 2).
    3. Этап блокировки белка. Инкубируйте срезы тканей в течение 5 минут в рабочем растворе разбавителя M.O.M.TM.
    4. Первичное антитело. Удалите из срезов избыток разбавителя M.O.M.TM. Разведите первичное антитело в разбавителе M.O.M.TM до подходящей концентрации. Инкубируйте срез в разбавленном первичном антителе в течение 30 минут (см. Примечание 3).
    5. .Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере.
    6. Вторичное антитело. Нанесите рабочий раствор биотинилированного реагента против мышиного IgG M.O.M. Инкубируйте срезы в течение 10 минут.
    7. Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере.
    8. Авидин конъюгат. Нанесите флуоресцеин авидин DCS, приготовленный в соответствии с инструкциями к набору M.O.M.TM. Инкубируйте секции в течение 5 минут (см. Примечание 4).
    9. Промойте срезы 2 раза по 5 минут в буфере.

      Окрашивание на второй антиген

    10. Этап блокировки авидина / биотина.Выполните блокировку авидина / биотина в соответствии с этапом 4. (Этот этап необходимо выполнить, чтобы предотвратить взаимодействие второго набора реагентов для маркировки с первым набором реагентов для маркировки).
    11. Этап блокировки мышиного Ig. Инкубируйте срезы в течение 1 часа в рабочем растворе блокирующего реагента M.O.M.TM Mouse Ig Blocking Reagent.
    12. Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере.
    13. Этап блокировки белка. Инкубируйте срезы в течение 5 минут в рабочем растворе разбавителя M.O.M.TM.
    14. Первичное антитело.Удалите из срезов избыток разбавителя M.O.M.TM. Разведите второе первичное антитело в разбавителе M.O.M.TM до подходящей концентрации. Инкубируйте секцию в течение 30 минут (см. Примечание 3).
    15. Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере.
    16. Вторичное антитело. Нанесите рабочий раствор биотинилированного реагента против мышиного IgG M.O.M. Инкубируйте срезы в течение 10 минут.
    17. Промойте срезы 2 раза по 2 минуты в буфере.
    18. Авидин конъюгат. Нанесите Texas Red ® Avidin DCS в концентрации 15-20 мкг / мл в буфере.Инкубируйте секции в течение 5-10 минут (см. Примечание 4).
    19. Промойте срезы 2 раза по 5 минут в буфере.
    20. Установите соответствующий монтажный материал VECTASHIELD®.

    ПРИМЕЧАНИЯ:

    1. Ткани, фиксированные альдегидом (например, формалин), имеют тенденцию быть автофлуоресцентными и могут затруднять интерпретацию специфического сигнала флуоресцеина.

    2. Для немышиной ткани пропустите шаг 5 и шаг 6.

    3. Оптимальные результаты с M.O.Набор M.TM обычно получают после 30-минутной инкубации первичных антител. Концентрации первичных антител должны быть оптимизированы для множественных применений маркировки.

    4. Определить оптимальный порядок флуоресцентной метки. Другие реагенты, конъюгированные с флуорохромом, стрептавидином или авидином, могут быть заменены после того, как будет установлен оптимальный сигнал / шум.

    5. Руководство по поиску и устранению неисправностей M.O.M. доступно в Интернете или по запросу.

    Скелетная мышца (замороженная, нефиксированная) — двойная метка
    • Альфа-саркогликан (м), M.Набор флуоресцеина O.M.TM (зеленый).
    • Мышечный актин (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).

    Двоеточие (замороженное) — двойная этикетка
    • Desmin (m), M.O.M.TM Fluorescein Kit (зеленый).
    • Периферин (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).

    Простата (замороженная) — двойная этикетка
    • Мышечный актин (m), набор флуоресцеина M.O.M.TM (зеленый).
    • Мульти-цитокератин (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).

    Карцинома груди (замороженная) — двойная этикетка
    • Рецептор эстрогена (m), M.Набор флуоресцеина O.M.TM (зеленый).
    • Мультицитокератин (m), базовый набор M.O.M.TM, стандартный набор VECTASTAIN® ABC-AP, субстрат Vector® Red AP (красный).

    Миндалины (замороженные) — Двойная этикетка
    • Ki67 (m), M.O.M.TM Basic Kit, Texas Red® Avidin DCS (красный). • CD20 (m), набор флуоресцеина M.O.M.TM (зеленый).
    Сравните цветовой контраст с соседней фотографией.

    Миндалины (замороженные) — двойная этикетка
    • Ki67 (m), M.O.M.TM Fluorescein Kit (зеленый).
    • CD20 (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS.Сравните цветовой контраст с соседней фотографией.

    Миндалины (замороженные) — двойная этикетка
    • p63 (m), M.O.M.TM Fluorescein Kit (зеленый).
    • Мульти-цитокератин (m), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).
    Сравните цветовой контраст с соседней фотографией.

    Миндалины (замороженные) — двойная этикетка
    • p63 (м), базовый набор M.O.M.TM, Texas Red® Avidin DCS (красный).
    • Мульти-цитокератин (m), набор флуоресцеина M.O.M.TM (зеленый). Сравните цветовой контраст с соседней фотографией.

    GBI Labs | Сверхчувствительный полимерный полимер HRP и AP, наборы для двойного и тройного окрашивания

    Наборы для многоцветного окрашивания полимера HRP и AP (небиотин)
    Многоцветное окрашивание позволяет просмотреть 2-3 целевых белка на одном срезе ткани.Наборы Polink-DS (двойное окрашивание) GBI Labs обнаруживают практически любые две комбинации первичных антител. Некоторые наборы специально разработаны для проверки коэкспрессии в одном и том же месте среза ткани.
    Наборы Polink-TS (тройное окрашивание) GBI Labs позволяют обнаружить 3 антигена за 5-6 часов. По желанию заказчика можно выбрать две комбинации цветов (коричневый / зеленый / красный или коричневый / красный / черный).
    Многократное окрашивание тканей человека View
    Многократное окрашивание тканей животных

    Наборы для определения полимера HRP и AP (небиотина)
    GBI Labs предлагает высококачественные полимерные (небиотиновые) наборы для обнаружения первичных антител мышей, кроликов, коз, крыс, кур, овец, армянских хомяков и морских свинок.Все вторичные антитела, используемые в нашей системе обнаружения, имеют высокую степень очистки. Комплекты Polink-1 (полимер в 1 этап) обеспечивают быстрое выполнение заказа. Комплекты детектирования Полинк-2 (двухступенчатый полимер) и Polink-2 Plus (двухступенчатый полимер) обеспечивают наилучшее соотношение сигнал / шум. Посмотреть Полимер HRP и AP для тканей человека

    Наборы для определения высокой специфичности тканей грызунов
    В наборах сверхчувствительных полимеров GBI Labs HRP и AP используются новейшие полимерно-конъюгированные вторичные антитела и запатентованный блокирующий буфер для обнаружения антител мыши на ткани мыши, антитела крысы на ткани крысы, антитела крысы на ткани мыши или антитела мыши на ткани крысы с очень чистым фоном .Просмотр Polymer HRP AP для обнаружения тканей животных

    IHC Gallary

    Новые продукты

    Набор для обнаружения человека на человеке — Наборы Klear для обнаружения человеческого полимера GBI Labs могут обнаруживать человеческие антитела на тканях человека без фона. Этот продукт без биотина обеспечивает отличную чувствительность и высокую специфичность — подробнее …

    Super Sensitive Nickel DAB — Обеспечивает резкое черное изображение, идеально подходящее для однократного, двойного или тройного окрашивания.